miR let-7家族在胰腺導管腺癌發生發展中的作用

曾 瑋 劉孟剛 劉宏鳴 謝 斌 袁 濤 楊俊濤 藍 翔 陳 平

胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤,其發病隱匿,預后差,死亡率高,治療手段有限[1]。而PDAC的發生發展過程中，相關mRNA與ncRNA應該是一個相互調控的動態網絡過程[2-3]。據此，本文嘗試分析胰腺癌RNA表達數據庫內多套mRNA與miRNA的表達譜數據，定義差異表達的分子，并利用已知的“轉錄因子-miRNA-mRNA”構建調控網絡。定義新的PDAC基因與miRNA。分析結果發現一組miRlet-7家族miRNA分子可能在調控網絡中其到重要作用，可能參與調控ALDH1A1、ZEB1與HMGA等基因，影響PDAC的發生與發展。

1 材料與方法

1.1 神經膠質瘤mRNA與miRNA表達譜數據

PDAC相關差異表達mRNA與miRNA數據來自于Pancreatic Expression Database(PED)數據庫[4]。在數據庫內篩選出比較PDAC組織樣本與正常組織樣本(包括配對樣本和非配對樣本)的mRNA表達譜數據集共12組，得到差異表達基因(t testP<0.05，|Fold Change|>2)。同時，篩選出比較PDAC組織樣本與正常組織樣本(包括配對樣本和非配對樣本)的miRNA表達譜數據集共6組，得到差異表達基因(t testP<0.05，|Fold Change|>2)。

1.2 miRNA與mRNA調控關系數據及miRNA疾病相關數據庫

miRNA與mRNA調控關系數據均為文獻報道證實數據。其中，轉錄因子調控miRNA數據來源于transmir數據庫[5]。miRNA靶向調控mRNA數據來自miRNAwalk數據庫[6]。miRNA與疾病關系數據來源于人類miRNA疾病數據庫(HMDD)[7]及人類miRNA疾病與生物學過程數據庫(PhenomiR)[8]。已知癌基因數據來自CGC(Cancer Gene Census)數據庫[9]，共收集488個已知癌基因。

1.3 構建miRNA-mRNA調控網絡與核心調控子網絡

尋找所有差異RNA分子間存在的調控關系，包括“轉錄因子-miRNA”以及“miRNA-mRNA”2種調控關系，最后將所有得到的不同分子間的調控關系進行整合，形成miRNA-RNA調控關系網絡。

核心調控子網絡定義：①所有子網絡中節點均為差異表達mRNA或者miRNA;②子網絡中轉錄因子、miRNA及靶基因至少各存在一個；③子網絡節點數不得少于5個。

2 結果

2.1 差異表達基因與差異表達miRNA

分析整理PED數據庫中的mRNA表達譜數據，共得到465個差異表達的基因。包括392個上調基因，73個下調基因。差異基因中有82個為已知癌基因[9]。所有差異表達基因用biNGO軟件[10]進行GOslim富集分析，結果發現差異表達基因大多富集到“細胞增殖”、“細胞分化”、“細胞骨架”及“細胞死亡”等功能(表1)。相關功能都與PDAC發生發展有密切關系[3]。

表1 差異表達基因GOslim功能富集結果

分析miRNA表達譜數據，得到97個差異表達的miRNA。包括87個上調的miRNA,10個下調的miRNA。97個miRNA其中有32個文獻報道與PDAC疾病相關[7-8]。另外部分miRNA有研究表明與其他腫瘤發生發展密切相關。例如，hsa-mir-125a可以促進非小細胞肺癌細胞的侵襲功能[11]，hsa-miR-222可以影響子宮內膜癌的細胞分化[12]。

2.2 構建miRNA-mRNA調控網絡

通過transmir數據庫[5]，發現其中有33個差異表達的miRNA可被11個差異表達的轉錄因子調控，形成48個“轉錄因子-miRNA”的調控關系。同時通過miRNAwalk數據庫[6]，發現其中7個差異miRNA可能調控了47個靶基因，形成了126個“miRNA靶向mRNA”的關系。

將以上2種調控關系整合成一個包含轉錄因子、miRNA及靶基因的整合網絡。該網絡包含88個節點，涉及174個調控關系。其中差異表達基因52個，差異表達miRNA 36個。在整合網絡中，通過遍歷搜索發現6個miR-let-7家族(hsa-let-7i、hsa-let-7d、hsa-let-7b、hsa-let-7g、hsa-let-7c、hsa-let-7e)與周圍的分子形成一個涉及到13個節點的子網絡(表2)。其中EGR1、TGFB1及ZEB1為對miRNA有調控作用的轉錄因子,ALDH1A1和HMGA2為靶基因。該5個基因全部屬于已知癌基因[9]；其中ALDH1A1基因目前已經被證實與PDAC的預后直接相關，可被作為PDAC預后分子標記[13]。HMGA2也被證實與PDAC的惡性程度呈顯著正相關，是PDAC非常重要的標記分子[14]。Simone Brabletz等[2]證實ZEB1可與miR-200家族相互調控影響PDAC的發展。這一現象在網絡中已有所體現。此外，EGR1與TGFB1很早已被證明與PDAC的發展及轉移密切相關[3]。雖然目前已有文獻報道miR-let-7家族在胰腺癌組織中呈高表達[15],然而還未有文獻報道miR-let-7家族在PDAC發生發展過程中的分子機制，miR-let-7家族與ALDH1A1、ZEB1、HMGA2、TGFB1及EGR1等基因間的調控關系及其與PDAC的發生發展的關系，至今未見文獻報道。因此，通過miRNA/mRNA調控網絡分析發現，miR let-7與上述分子很可能存在調控關系，進而影響PDAC。

表2 核心調控子網絡中基因與miRNA的差異表達情況

3 討論

miRlet-7家族是生物體內一組進化來源相同的miRNA分子，由于其序列相似，所以在某些情況下，其在生物體內參與的功能有很多類似。目前，已有研究討論miRlet-7家族與細胞分化以及腫瘤的關系[16-17]，曲杰等[16]通過合成hsa-let-7b轉染乳腺癌細胞，發現其可以明顯降低細胞的遷移。Kong 等[17]發現hsa-let-7可以負向調控EZH2基因的表達，進而影響前列腺癌細胞的結構域增殖。雖然，Kent等[15]已經發現let-7家族在胰腺癌中顯著高表達，但未深入研究miR let-7家族在胰腺癌中具體分子機制。本文利用PDAC的全基因組表達數據與miRNA表達數據，尋找定義神經膠質瘤發展過程中的核心mRNA-miRNA調控網絡，并由此得到miR-let-7家族相關的“mRNA-miRNA”核心調控網絡。其網絡中所有其他基因與miRNA目前都已被大量文獻證實與PDAC的發生發展有重要關系。此外，部分mRNA-miRNA調控關系也已被研究證實與PDAC相關。所以可能提示，hsa-let-7家族可以與ALDH1A1、ZEB1、HMGA2、TGFB1與EGR1等基因相互調控并影響PDAC的發生發展。因此，深入研究miR-let-7家族與上述分子之間的具體調控機制，并如何影響PDAC的發生發展將是我們下一步工作的重點。

由于腫瘤發病機制的高異質性與復雜性，目前研究積累的成果還遠遠不能解釋PDAC發病的分子機制[18]。定義PDAC相關癌基因與miRNA對研究其發病機理和治療診斷具有非常重要意義。我們利用大規模膠質瘤樣本的RNA分子表達數據，代入“轉錄因子-miRNA-基因”數據，尋找PDAC發病的調控網絡。挖掘批量的PDAC相關分子調控機制與相關RNA分子。此外，我們未使用算法預測的miRNA/mRNA調控關系，只使用目前文獻報道過的mRNA/miRNA調控關系，提高了miRNA/mRNA調控網絡的準確性與穩定性。我們相信，隨著癌癥基因與ncRNA的表達數據的進一步積累，同時，伴隨著miRNA與基因之間的調控關系數據的進一步增加。通過本文的mRNA/ncRNA調控網絡分析方法，將可以挖掘更多的潛在的腫瘤相關RNA分子。

[1] Shi J,Wu C.Meta analyses of risk factors for pancreatic cancer in China 〔J〕.Pancreatic Cancer Study,2004,4(3):154-158.

[2] Simone Brabletz,Karolina Bajdak,Simone Meidhof,et al.The ZEB1/miR-200 feedback loop controls Notch signaling in cancer cells〔J〕.EMBO J,2011,30(4):770-782.

[3] Gong X,Qin XL.Evolve of pancreatic cancer’s medicine cure 〔J〕.Chinese Clinical Oncology，2007,12(1):68-74.

[4] Ma W,Yang D,Gu Y,et al.Finding disease-specific coordinated functions by multi-function genes:insight into the coordination mechanisms in diseases〔J〕.Genomics,2009,94(2):94-100.

[5] Wang J,Lu M,Qiu C,et al.TransmiR:a transcription factor-microRNA regulation database〔J〕.Nucleic Acids Res,2010,38(Database issue):D119-122.

[6] Dweep H,Sticht C,Pandey P,et al.miRWalk--database:p-rediction of possible miRNA binding sites by “walking” the genes of three genomes〔J〕.J Biomed inform,2011,44(5):839-847.

[7] Lu M,Zhang Q,Deng M,et al.An analysis of human microRNA and disease associations〔J〕.Plos One,2008,3(10):3420.

[8] Ruepp A,Kowarsch A,Schmidl D,et al.PhenomiR:a kno-wledgebase for microRNA expression in diseases and biological processes〔J〕.Genome Biology,2010,11(1):R6.

[9] Futreal PA,Coin L,Marshall M,et al.A census of human cancer genes〔J〕.Nature Reviews,2004,4(3):177-183.

[10] Maere S,Heymans K,Kuiper M.BiNGO:a Cytoscape plugin to assess overrepresentation of gene ontology categories in biological networks〔J〕.Bioinformatics,2005,21(16):3448-3449.

[11] 江黎黎，張清富，常繼紅，等.hsa-miR-125a-5p促進非小細胞肺癌細胞侵襲〔J〕.中國肺癌雜志，2009，12(9):951-955.

[12] Qian K,Hu L,Chen H,et al.Hsa-miR-222 is involved in differentiation of endometrial stromal cells in vitro〔J〕.Endocrinology，2009,150(10):4734-4743.

[13] Kahlert C,Bergmann F,Beck J,et al.Low expression of aldehyde dehydrogenase 1A1(ALDH1A1)is a prognostic marker for poor survival in pancreatic cancer〔J〕.BMC Cancer，2011,11(3):275.

[14] Piscuoglio S,Zlobec I,Pallante P,et al.HMGA1 and HMGA2 protein expression correlates with advanced tumour grade and lymph node metastasis in pancreatic adenocarcinoma〔J〕.Histopathology，2012,60(3):397-404.

[15] Kent OA,Mullendore M,Wentzel EA,et al.A resource for analysis of microRNA expression and function in pancreatic ductal adenocarcinoma cells〔J〕.Cancer Biol Ther，2009,8(21):2013-2024.

[16] 曲 杰，王勝林，呂喜英，等.MiR let-7b 抑制乳腺癌MCF-7 細胞遷移及其機制〔J〕.江蘇大學學報(醫學版),2012,22(4):328-331.

[17] Kong D,Heath E,Chen W,et al.Loss of let-7 up-regulates EZH2 in prostate cancer consistent with the acquisition of cancer stem cell signatures that are attenuated by BR-DiM〔J〕.PLos One,2012,7(3):33729.

[18] Abramson MA,Jazag A,van der Zee JA,et al.The Molecular Biology of Pancreatic Cancer〔J〕.Gastrointest Cancer Res，2007,1(4Suppl 2):S7-S12.