人腎上腺皮質癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

徐文清 肖 戈 吳義高 黃 福 王 尉 胡衛列

腎上腺皮質癌(adrenocortical carcinoma)是發生于腎上腺皮質的1種惡性程度高、預后差的惡性腫瘤[1]。臨床較為少見，發病率為1/200萬人，初次就診即有40%發現遠處轉移，5年生存率為低于30%[2]，因此臨床上很獲取新鮮的腎上腺皮質癌標本，同時觀察其發生及發展過程也存在困難。因此構建腎上腺皮質癌動物模型顯的極為重要。本研究應用人腎上腺皮質癌細胞株SW-13細胞接種裸鼠，建立了人腎上腺皮質癌裸鼠移植瘤模型。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎上腺皮質癌細胞株SW-13購于中科院上海細胞所。胎牛血清、0.25%胰酶消化液購于Hyclone公司，L-15細胞培養液購于杭州吉諾公司。實驗用的20只BALB/C裸鼠由南方醫科大學動物實驗中心提供，雌雄不限，鼠齡4～6周，體重20～25 g。飼養條件為SPF(specific-pathogen free)級。籠具、墊料、食料及飲用水均經滅菌處理，按標準方式給予裸鼠自由活動及進食。

1.2 細胞培養

SW-13細胞培養于含10%胎牛血清的L-15細胞培養液中，在37℃，5%CO2條件下培養，1～2天換液1次，當細胞生長處于對數期時，用0.25%胰酶消化計數，臺盼藍測定細胞活力達90%以上。PBS洗3次，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為3×107/ml備用。

1.3 細胞接種

將調整好的細胞濃度為3×107/ ml的SW-13細胞共5 ml，以1 ml注射器抽取細胞懸液，每只裸鼠接種0.2 ml，即接種細胞數量為6×106個，接種部位為裸鼠左側腋下，每次注射后均勻抽取0.2 ml PBS再次注射以保證腫瘤細胞全部注入裸鼠皮下，接種前碘伏消毒皮膚，共接種20只裸鼠。

1.4 移植瘤觀察

接種5天后逐日觀察接種部位，以了解腫瘤生長潛伏期和生長速度，同時大體觀察移植瘤的形態、體積、顏色以及與周圍組織的關系，移植瘤成瘤潛伏期為接種日至長出肉眼可見腫瘤的時間(d)。成瘤后每4天1次測量腫瘤的長徑(a)及短徑(b)，按公式V=1/6(πab2)計算腫瘤體積，共觀察10周，繪制腫瘤生長曲線圖。成瘤百分率(%)=接種成功只數/接種總數×100%。

1.5 組織病理學檢查

接種后第10周處死裸鼠，手術剝離腫瘤，先對腫瘤行大體觀察，然后用10%福爾馬林液固定，石蠟包埋切片HE染色，并于顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 SW-13細胞培養結果

SW-13細胞培養于含10%胎牛血清的L-15細胞培養液中，培養3天后于倒置相差顯微鏡下觀察，可見SW-13細胞呈貼壁生長，主要呈多角形或不規則形。

2.2 移植瘤生長特性

裸鼠在接種SW-13細胞后生長情況良好。平均接種(18±1.2)d后，19只裸鼠在接種部位均可見腫瘤硬塊，據此推算平均成瘤潛伏期為18 d，成瘤百分率為95%(19/20)，此后腫瘤生長速度加快，腫瘤體積倍增時間約(10±1.8)d，平均于接種后(60±1.5)d，腫瘤最大徑達20 mm，此后腫瘤生長速度減慢(圖1)。移植瘤外觀上凸出于皮面，多為橢圓形，表面多呈結節狀，質地偏韌，移動度可，皮膚無破潰及紅腫。手術摘除后，19例腫瘤包膜均完整，未見向肌肉侵襲生長現象，切面呈魚肉樣，中間可見部分壞死灶。

2.3 移植瘤病理學特征

HE染色結果顯示，腫瘤呈彌漫性分布，細胞核大小不一，核分裂指數≥5 / 50 HP，并可見不典型核分裂，根據weiss標準可初步診斷為腎上腺皮質癌。

圖1 腫瘤生長曲線

3 討論

在實驗研究中，動物實驗研究是從基礎實驗研究向臨床實驗研究的一個重要過渡，而建立動物模型是動物實驗研究的基礎。本研究采用人腎上腺皮質癌細胞株SW-13細胞成功建立了人腎上腺皮質癌裸鼠移植瘤模型，并對移植瘤部分生長特性進行觀察，并對其進行病理學鑒定，該模型為研究腎上腺皮質癌的發病機制及診治方法提供了實驗平臺。

建立動物腫瘤模型方法包括腫瘤細胞接種法、腫瘤組織塊接種法以及藥物誘導等不同方法。腫瘤細胞接種法是采用腫瘤細胞懸液注入動物體內從而建立腫瘤模型的方法，該方法具有操作簡單、時間短、無需特殊處理等優點，且移植成功率較高，應用較為廣泛。本研究采用腫瘤細胞接種法，移植成功率為95%(19/20)，其中1只裸鼠未能成瘤考慮于操作不當致腫瘤細胞未能注入裸鼠皮下有關，接種成功率與國內外報道的相似[3-4]。

不同的腫瘤模型建立方法，腫瘤生長特性也不相同。本次采用SW-13細胞懸液移植，平均成瘤潛伏期為18 d，移植瘤大小及形狀較為均勻，特別適用與對腫瘤體積均一性要求高的實驗。從腫瘤生長曲線可見，接種后48～60 d腫瘤生長最為迅速，而此前及此后腫瘤生長速度均相對緩慢，腫瘤生長特征與Pinto研究相近[5]，提示裸鼠移植瘤實驗最佳實驗試劑為接種后48～60 d。

移植瘤能否保持腫瘤原有特征是移植瘤模型建立成功的關鍵[6]。有研究顯示裸鼠肺癌移植模型在生長過程中生物學特征不穩定，出現原有標志物丟失或產生新的標志物。通過組織病理學驗證，本研究所建立的移植瘤病理學特征與腎上腺皮質腺癌的特征極為相似，提示該模型可用于腎上腺皮質癌的實驗研究。

總之，本研究建立的人腎上腺皮質癌皮下移植瘤模型具有操作簡單、觀察方便、成功率高的優點，可應用于腎上腺皮質癌的實驗研究。

[1] Grunenwald S，Caron P.Adrenocortical carcinomas：therapeutic advances in 2011〔J〕.Ann Endocrinol (Paris)，2011，(Suppl )：S8-S14.

[2] Lafemina J，Brennan MF.Adrenocortical carcinoma：past，present，and future〔J〕.J Surg Oncol，2012，106(5)：586-594.

[3] Hantel C，Beuschlein F.Mouse models of adrenal tumorigenesis〔J〕.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2010，24(6)：865-875.

[4] 沈圓兵，陳余清，王效靜，等.HIF-1α基因沉默對人肺腺癌細胞A549裸鼠移植瘤生長及survivin表達的影響〔J〕.實用癌癥雜志，2011，26(2)：111-114.

[5] Pinto E M，Morton C，Rodriguez-Galindo C，et al.Establishment and characterization of the first pediatric adrenocortical carcinoma xenograft model identifies topotecan as a potential chemotherapeutic agent〔J〕.Clin Cancer Res，2013，19(7)：1740-1747.

[6] 涂少華，沈江帆，張 隆，等.人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立〔J〕.標記免疫分析與臨床，2012，19(5)：291-293.