丁苯酞對血管性癡呆大鼠腦組織BDNF表達的影響

趙 俊 李 昕 孫玉華

(河南大學淮河醫院神經內科，河南 開封 475000)

近年來，隨著我國老齡化趨勢的加重，老年癡呆的患者數量呈逐年增加的趨勢。而血管性癡呆(VD)主要由腦血管性病變引起，導致患者認知、學習和記憶障礙。研究表明，早期干預及合理治療，能夠延緩病情的發展。本實驗旨在觀察丁苯酞作用于VD大鼠后腦內源性神經營養因子(BDNF)變化的影響, 探討丁苯酞對 VD 的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物及主要試劑 14～15月齡的健康 SD 大鼠 60 只, 體重550～650 g。由河南省鄭州大學實驗動物中心提供。丁苯酞:批號: 050106;兔抗鼠BDNF多克隆抗體、SP 免疫組化試劑盒、BDNF ELISA 檢測試劑盒購自博士德公司，NAB 顯色試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。

1.2動物模型、動物分組與給藥

1.2.1動物模型的建立: 根據 Olsso n 方法〔1〕結扎雙側頸總動脈。假手術組分離但不結扎頸總動脈。

1.2.2動物分組與給藥方法 將造模成功的 VD 大鼠隨機分為模型組(MDG)、丁苯酞組(DBT)、假手術組(SOG)，每組20只。DBT組造模后第 61天開始治療,每灌服丁苯酞 12 mg/100 g; MDG 和 SOG 以等量消毒花生油灌胃;各組均給藥1次/d, 連續給藥 30 d。

1.3癡呆標準 以SOG組大鼠逃避潛伏期的平均值作為參考,計算結扎大鼠逃避潛伏期的平均值與參考值之差占該鼠逃避潛伏期的比值,若該值>20%為癡呆鼠。

1.4認知功能測試及病理學檢測

1.4.1大鼠認知能力測試 采用 Y型電迷宮法于模型制作 60 d后再三等分 Y型電迷宮內進行大鼠學習能力測試。先將大鼠放入迷宮內適應 5 min, 使其對三臂均探索進入,然后從起步區臂出發, 開始以隨機次序變換測試。設定電壓 40 V,延遲時間 5 s。電擊后大鼠直接逃避至安全區為正確反應, 否則為錯誤反應。每測1次休息 30 s ,測 10次休息 5 min。大鼠學習成績以連續 10次測試中有 9次 (9/10)正確反應時所需的電擊次數(嘗試次數)表示。每次測試均在安靜和光線稍暗的條件下進行。6 h后進行記憶能力測試, 對于上述達到 9 /10標準的大鼠再次測試 10次,記錄其中正確反應的次數。

1.4.2電鏡標本的制備 大鼠斷頭處死后, 參照大鼠腦圖譜,迅速切取右側海馬區組織塊, 迅速放入預冷 4e 的 4% 的戊二醛中固定,常規脫水、 Epo n812 環氧樹脂包埋, LKB超薄切片,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,日立 H- 7500 型透射電鏡觀察。

1.4.3免疫組化染色 采用SP法及定量分析計數方法。在海馬CA1區,分別選擇 3 個相鄰視野, 在 400 倍光鏡下隨機查 100 個神經元計數陽性細胞數,結果取 3 個視野的平均值。

1.5BDNF 含量測定 90 d后快速處死動物后,取左側大腦半球,勻漿, 離心后取上清,采用 BDNF 的 ELISA 試劑盒,按說明書逐步操作,最后在酶標儀 450 nm 處讀出 A 值, 依照標準含量與 A值建立一元回歸方程以及標準曲線, 取在標準曲線范圍內的測量值作方差分析。

2 結 果

2.1病理學電鏡結果 SOG組未見明顯病理變化;MDG可見神經細胞高度水腫,皮質下和海馬區有結構較松散的軟化灶,胞體縮小,胞核固縮,胞漿致密,海馬CA1區細胞數減少, 胞間距離增大; DBT組皮質偶見小的軟化灶,細胞數和形態接近正常對照組。見圖1。

2.2各組大鼠學習記憶能力測試 見表1。

2.3各組海馬內BDNF免疫反應陽性細胞數 MDG組、DBT組免疫反應陽性細胞數(77.875±2.031，92.750±4.713)顯著高于SOG組(64.250±3.772)(P<0.05)。

2.4各組動物大腦內 BDNF的含量 MDG組、DBT組大鼠腦中BDNF含量〔(28.69±2.484)ng/g,(37.174±3.878)ng/g〕顯著高于SOG組〔(18.875±3.903)ng/g〕(P<0.05)。

MDG組

DBT組

SOG組

組別嘗試次數10次正確數SOG組44.1 ± 2.28.75 ± 1.06MDG組79.9 ± 2.11)5.12 ± 1.131)DBT組55.7 ± 2.61)2)7.51 ± 1.071)2)

3 討 論

隨著我國老齡化趨勢的加重，VD的發病率也逐年提高；缺血性損害已成為公認的造成VD的主要病因。丁苯酞作為一種線粒體保護劑，其左旋體存在于芹菜籽中〔2〕。其主要作用是維護線粒體的結構和功能,從而達到改善缺血區微循環的目的〔3，4〕。有動物實驗表明〔5〕,在缺血性腦卒中治療中丁苯酞具有很好的作用。近年來，一類種類較多的特殊蛋白質分子——神經營養因子，引起了學者的關注。而BDNF作為其中的一種，對腦缺血有保護作用。本實驗結果發現丁苯酞能夠明顯提高缺血后大鼠的記憶和學習能力,并逐步改善認知功能。作為大腦邊緣系統重要組成部分的海馬在學習和記憶等一系列高級神經活動中起著關鍵的作用,因此海馬結構的損害可能是引發VD的重點之一。本實驗也表明丁苯酞確實能減少海馬神經元在缺血狀態下的壞死程度,從而減輕腦組織不可逆的損害,與近年來國內外專家的研究結果相一致〔6〕。

神經營養因子是一類特異性的蛋白質。BDNF是重要的神經營養因子家族成員，隨著進一步的研究, 人們發現BDNF具有明確的促進神經細胞生長、分化和存活作用;有研究表明〔7〕，外源性BDNF的注入，可造成腦梗死體積縮小,同側大腦新皮質神經元細胞核中廣泛分布BDNF樣免疫反應產物,說明BDNF可以對抗缺血性腦病。

綜上，丁苯酞通過內源性BDNF的表達實現對神經元的保護作用, 但是關于丁苯酞如何啟動了內源性BDNF表達，機制尚不十分清楚，有待今后進一步研究闡明。

4 參考文獻

1Olsson Y, Brun A, Engiuund E.Fundamental pathological in vascular dementia 〔 J 〕1 Acta Neurol Suppl, 1996；168(1):31-8.

2崔麗英, 李舜偉, 呂傳真,等.恩必普軟膠囊治療中度急性缺血性卒中的多中心開放臨床研究〔J〕.中國腦血管病雜志,2005;2(3):112 -5.

3熊 杰,馮亦璞.丁基苯酞對局灶性腦缺血過程中線粒體損傷的保護作用 〔J〕.藥學學報,2000;35(6):408-12.

4董高翔, 馮亦璞.丁基苯酞對局部腦缺血再灌注大鼠腦線粒體ATPase抗氧化酶活性和脂質過氧化的影響〔J〕.中國醫學科學院學報,2002;24(1):93-7.

5Fiorella D, Heiserman J,Prenger E,etal.Assessment of the reprodu cibility of postprocessing dynamic CT perfusion data〔J〕.AMJN, 2004;25(1):97-107

6沈瑞樂, 王興萍, 滕軍放, 等.丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠海馬膽堿乙酰基轉移酶 mRNA表達的影響〔J〕.鄭州大學學報(醫學版),2008;43(2):306-8.

7Hall J,Thomas KL,Everitt BJ.Rapid and selective induction of BDNF expression in the hippocampus during contextual learning〔J〕.Nat Neurosci, 2000;3(6):533-5.