轉(zhuǎn)鐵蛋白與細(xì)胞穿膜肽共修飾脂質(zhì)體的制備及其抗腫瘤效果

宿懷予 周 勁

(樂山市人民醫(yī)院，四川 樂山 614000)

脂質(zhì)體是具有良好的生物相容性的傳遞載體〔1〕，在脂質(zhì)體表面修飾配體是構(gòu)建主動(dòng)靶向脂質(zhì)體的重要方式。脂質(zhì)體的主動(dòng)靶向是指在脂質(zhì)體雙層裝載抗體、糖基、激素、受體配體等特異性歸巢裝置(homing devices)，使其靶向到特異性組織〔2〕。細(xì)胞穿膜肽(TAT)是艾滋病毒1型(HIV-1)LTR反式激活基因表達(dá)的一種蛋白〔3,4〕，能夠穿過與之接觸的任何細(xì)胞的細(xì)胞膜〔3〕，而對細(xì)胞膜沒有損傷。轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)廣泛存在于人體體液及細(xì)胞液中，可以與體液中游離的Fe3+結(jié)合然后再與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合并被細(xì)胞內(nèi)吞從而起到運(yùn)輸鐵原子入胞的作用。由于腫瘤細(xì)胞增殖速度導(dǎo)致它們對鐵元素的需求量大，在其表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)是正常細(xì)胞的2～7倍，與TF的親和力是正常細(xì)胞的10～100倍〔5〕。本研究以脂質(zhì)體為載體，紫杉醇為模型藥物，制備了TAT和TF共同修飾的脂質(zhì)體，對其理化性質(zhì)和體內(nèi)外抗腫瘤能力進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1材料與細(xì)胞 SizerNano ZS90型激光粒度儀及ZETA電位分析儀(英國Malvern instruments Ltd)。TAT(YGRKKRRQRRR，上海吉爾生物科技公司)；TF(美國sigma公司)；大豆磷脂(SPC，美國sigma公司)；DSPE-PEG2000(美國Avanti polar lipids)；FITC-PE(美國sigma)；DSPE-PEG3500-MAL(美國Avanti polar lipids)；其余試劑為分析純。人肝癌細(xì)胞HepG2購自ATCC。

1.2方法

1.2.1TAT修飾紫杉醇脂質(zhì)體(TATLP-PTX)的制備 參照文獻(xiàn)〔6,7〕方法合成TAT-PEG2000-DSPE。精密稱取大豆磷脂11.50 mg，膽固醇0.96 mg，DSPE-PEG2000 1.15 mg，紫杉醇0.25 mg，將以上材料和藥物溶于氯仿中，在茄形瓶中減壓蒸餾成膜，除去有機(jī)溶劑，置于真空干燥器中過夜，使其充分干燥，加入1 ml PBS水化得到TATLP-PTX。同法制得未修飾紫杉醇脂質(zhì)體(LP-PTX)。用FITC標(biāo)記的磷脂取代適量的大豆磷脂，制備得到FITC標(biāo)記的脂質(zhì)體。

1.2.2TF與TAT共修飾紫杉醇脂質(zhì)體(TF/TATLP-PTX)的制備 參照文獻(xiàn)〔8,9〕用后插入法制備TF/TATLP-PTX。首先將TF巰基化，再與商品化的DSPE-PEG3500-MAL孵育得到TF膠束，將膠束后插入已經(jīng)制備的TATLP-PTX得到TF/TATLP-PTX。

1.2.3脂質(zhì)體的形態(tài)，粒徑，Zeta電位和包封率 取脂質(zhì)體適量用馬爾文激光粒度儀測定其粒徑以及電位，采用葡萄糖凝膠柱色譜法分離脂質(zhì)體與未包載的PTX,將過柱后的脂質(zhì)體采用甲醇破乳，用HPLC法在227 nm檢測PTX含量。按照EE%=W包/W投×100%計(jì)算包封率。

1.2.4MTT法考察載藥脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性 培養(yǎng)HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時(shí)加入無菌過濾后的脂質(zhì)體，使每孔的最終脂質(zhì)濃度為5.0 μmol/ml。將孔板移入37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)24、48、72 h后取出，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200 μl DMSO，37℃避光振搖15 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔的光密度值(OD)。

1.2.5體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入適量不同處方脂質(zhì)體，使孔中脂質(zhì)體濃度為0.2 mg/ml，37℃孵育2 h和4 h后除去含脂質(zhì)體培養(yǎng)基，冷PBS清洗2次，0.25%胰酶消化后離心，PBS清洗3次，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞熒光值。為了定性觀察細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取情況，將脂質(zhì)體與細(xì)胞共同孵育4 h后，將細(xì)胞用PBS漂洗三次，加入2 μg/ml DAPI溶液，室溫孵育15 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15min，棄去多聚甲醛，用冰PBS保存。置激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取情況。

1.2.6肝癌異位瘤模型的構(gòu)建及TF/TATLP-PTX對腫瘤的生長抑制實(shí)驗(yàn) HepG2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后將其懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)濃度至5×107個(gè)/ml。取4～6周齡，體重20～25 g的雄性裸鼠，將準(zhǔn)備好的HepG2細(xì)胞懸濁液皮下接種于裸鼠背部，每只裸鼠接種0.1 ml細(xì)胞懸濁液。接種后1～2 w可見背部長出腫瘤塊，證明接種成功。將建瘤成功后的30只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為TF/TATLP-PTX組、TATLP-PTX組、TF修飾紫杉醇脂質(zhì)體(TFLP-PTX)組、LP-PTX組和生理鹽水組。荷瘤裸鼠每天觀察其活動(dòng)度和飲食習(xí)慣，每2天給藥一次并測量其腫瘤大小。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間比較行t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1脂質(zhì)體的表征 制備得到的TF/TATLP-PTX的粒徑約135 nm，PDI<0.3。紫杉醇的包封率為85.3%。見表1。

表1 脂質(zhì)體的表征(n=3)

2.2TF/TATLP-PTX抑制腫瘤細(xì)胞的增殖 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組載藥脂質(zhì)體均能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且腫瘤細(xì)胞的存活率隨著給藥時(shí)間的延長而降低，給藥72 h后，以生理鹽水組為對照，LP-PTX、TFLP-PTX、TAT、TATLP-PTX和TF/TATLP-PTX組肝癌HepG2細(xì)胞存活率分別為62.4%、45.5%、39.2%和17.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

與LP-PTX、TATLP-PTX和TFLP-PTX比較：1)P<0.01；與24 h和48 h TF/TATLP-PTX比較：2)P<0.01

2.3TF/TATLP的體外腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 如圖2所示，腫瘤細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取效率隨著時(shí)間的延長而增強(qiáng)。HepG2細(xì)胞對TF/TATLP的攝取效率分別是TATLP、TFLP和LP的2.2倍、2.7倍和3.9倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明載藥脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用主要是由于腫瘤細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取效率升高所致。定性的細(xì)胞攝取結(jié)果見圖3，TF/TATLP組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于TATLP組、TFLP組和LP組，這與定量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

與LP、TATLP、TFLP比較:1)P<0.01；與2 h TF/TATLP比較：2)P<0.01

圖3 HepG2細(xì)胞對FITC標(biāo)記的不同脂質(zhì)體的攝取

2.4TF/TATLP-PTX抑制荷瘤裸鼠腫瘤的生長 荷瘤裸鼠治療實(shí)驗(yàn)以生理鹽水組為對照，給藥20 d后，生理鹽水組體積變?yōu)榻o藥前的2.55倍，LP-PTX、TFLP-PTX、TATLP-PTX和TF/TATLP-PTX組腫瘤體積分別增長到原體積的2.22、1.73、1.89、1.29倍，與其他組差異顯著(P<0.01)。見圖4。

與LP-PTX、TATLP-PTX、TFLP-PTX比較：1)P<0.01；

3 討 論

TAT作為一種非特異性的“功能性分子”，能夠穿過與之相接觸的任何細(xì)胞的細(xì)胞膜〔3〕，但是由于其不能區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，也限制了其應(yīng)用。有研究表明，在肝癌細(xì)胞表面有大量的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)，可以作為肝癌靶向的特異性配體〔10〕。然而特異性配體修飾的載體主要是由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞攝取，這種攝取方式受特異性受體的影響具有飽和效應(yīng)〔11〕。將TAT和特異性配體TF共同修飾到脂質(zhì)體表面可以互補(bǔ)各自的優(yōu)劣勢，對載體的入胞能力和選擇特異性有很大改善，能很好地彌補(bǔ)特異性和非特異性配體的入胞限制。

本研究成功制備了TF/TATLP-PTX，共聚焦定性觀察細(xì)胞攝取結(jié)果顯示，共修飾脂質(zhì)體的熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于TF修飾脂質(zhì)體和TAT修飾脂質(zhì)體。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TF與TAT能夠有效發(fā)揮轉(zhuǎn)鐵蛋白的特異性識(shí)別作用和TAT的穿膜作用，二者在入胞的過程中發(fā)揮協(xié)同作用。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TF/TATLP-PTX對HepG2細(xì)胞具有最好的增殖抑制效果。這與細(xì)胞攝取的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。共修飾脂質(zhì)體對腫瘤組織的生長抑制能力最強(qiáng)。綜述所述，本研究構(gòu)建了TF與TAT共同修飾的載紫杉醇脂質(zhì)體，考察了脂質(zhì)體的粒徑、電位和包封率。通過體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了構(gòu)建的脂質(zhì)體與HepG2腫瘤細(xì)胞具有高度親和力和高效穿透能力。體內(nèi)腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TF與TAT共同修飾的載紫杉醇脂質(zhì)體能夠有效抑制腫瘤的生長，是一種潛在的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)。

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