內皮型一氧化氮合酶基因多態性在血管性認知障礙發病中的作用

張秀麗 王 雁 隋愛華

(青島大學醫學院附屬醫院神經內科，山東 青島 266003)

血管性認知障礙(VCI)是一種多基因與環境因素相互作用的疾病，其發病機制至今仍 不明。尋找VCI的易感基因，有助于預測疾病風險。一氧化氮(NO)是一種多功能血管源性細胞因子，它可以調節血管舒張功能，調整血壓，參與維持血管穩態、抗血小板聚集和單核細胞黏附、抑制動脈粥樣硬化等作用。NO是由血管內皮細胞在一氧化氮合酶(NOS)催化作用下合成的，人類的NOS存在三種亞型：內皮型NOS(eNOS)，神經元型NOS(nNOS)和誘導型NOS(iNOS)〔1〕。其中eNOS的表達直接關聯循環中NO的生成量，影響NO的生物活性〔2〕。所以，eNOS的編碼基因被認為是腦血管病的候選基因〔3〕。近幾年有大量研究報道eNOS基因894G/T位點和eNOS 4b/4a位點多態性與多種疾病相關，如：高血壓〔4，5〕、冠心病〔6〕、腦梗死〔7〕等，但是其與VCI的相關性研究不多。基于此，本研究測定了中國北方漢族人群eNOS基因894G/T位點和eNOS 4b/4a位點的基因多態性，試圖分析其與VCI的相關性，探討eNOS基因在VCI發病中的機制。

1 資料與方法

1.1研究對象 VCI組來自2009年1月至2013年1月，我院神經內科住院及門診VCI患者146例，男77例，女69例。對照組為同期我院體檢中心健康體檢者160例，男86例，女74例，該組人群無肝、腎及血液、自身免疫性疾病，無腦血管病史。此項研究獲得研究對象的同意及倫理委員會批準。

1.2診斷標準 收集每個人的臨床和生化資料，根據蒙特利爾認知評估量表(MoCA)評分<26分(受教育年限<12年則加1分，以校正文化程度的偏倚)，漢密頓抑郁量表(HAMD)評分<7分，Hachinski缺血量表評分>7分篩選VCI患者，并經過至少2名神經內科專科醫師確認所有量表評分分值。VCI的診斷依據Rockwood等〔8〕制定的診斷標準，并排除以下情況：①存在嚴重軀體疾病和殘疾等影響神經心理學測試者；②缺少影像學資料者；③符合美國精神疾病統計和診斷手冊第四版DSM-Ⅳ抑郁癥和精神病的患者；④其他可能引起認知功能障礙的疾病(如腦炎、癲癇、腦外傷、正常顱壓腦積水、內分泌疾病、肝腎功能不全、酗酒或者藥物濫用者、維生素缺乏、自身免疫性疾病和腫瘤等)。高血壓患者診斷依據1999年世界衛生組織(WHO/ISH) 高血壓的診斷標準: 在未服抗高血壓藥的情況下, 收縮壓≥140 mmHg 和(或)舒張壓≥90 mmHg,且至少3次非同日血壓達標為標準, 或已確診為高血壓正在服用抗高血壓藥物，排除繼發性高血壓。

1.3標本采集 所有研究對象在入院后第2天清晨采取空腹外周靜脈血3 ml，應用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。紫外分光法測定DNA含量。

1.4eNOS894G/T位點基因多態性檢測 引物序列由上海生工生物技術有限公司合成，上游引物5′-TCCCTGAGGAGGGCATGAGGCT-3′，下游引物5′-TGAGGGTCACACAGGTTCCT-3′。PCR總反應體系20 μl，其中上游和下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，Premix Ex Taq10 μl，雙蒸水6 μl。循環條件為95℃預變性5 min，98℃變性10 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環33次，最后延伸72℃10 min結束反應。取PCR產物5 μl在BanⅡ內切酶(英國BioLabs公司)作用下進行酶切反應(37℃水浴8 h)，產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳后行EB染色分析和鑒定eNOS 894G/T基因型。

1.5eNOS 4b/4a位點基因多態性檢測 上游引物5′-AGGCCTATGGTA GTCCTT- 3′，下游引物5′-TCTCTTAGTGTGTGGTCA-3′。PCR反應體系同上。循環條件為95℃預變性5min，后進入循環98℃預變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30次，最后延伸72℃10 min結束反應。取PCR擴增產物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳，并進行EB染色分析和鑒定eNOS 4b/4a基因型。

1.6DNA序列測定 取10%的PCR擴增產物，送上海生工生物技術有限公司測定DNA序列，驗證PCR擴增產物基因型。

1.7統計學方法 應用SSPS17.0軟件進行統計分析，直接計數法統計基因型和等位基因頻率。以單因素方差分析(ANOVA)對定量資料進行比較。以χ2檢驗對定性資料進行比較，并驗證等位基因是否符合Hardy-Weinberg定律。

2 結 果

2.1一般臨床資料的比較 兩組在年齡、性別、吸煙、飲酒、糖尿病、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平的比較上沒有統計學意義(P>0.05)。而在高血壓、血漿高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平比較上存在差異(P<0.05)，見表1。

2.2eNOS 894G/T位點、4b/4a位點 基因型的頻率分布 兩組各多態性位點基因型頻率的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在eNOS894G/T位點,VCI組患者TT基因型頻率顯著高于對照組(χ2=15.43，P<0.05)，T等位基因頻率也顯著高于對照組(χ2=15.03，P<0.05)，經過高血壓分層后，在高血壓(+)亞組中，VCI組與對照組之間的這種差異仍具有統計學意義(χ2=6.71，P<0.05；χ2=6.57，P<0.05)，而在高血壓(-)亞組中，VCI組與對照組之間雖然存在差異，但是沒有統計學意義(χ2=2.63，P>0.05；χ2=2.68，P>0.05)，見表2,圖1～圖3。在eNOS4b/4a位點，兩組aa基因型和a等位基因頻率的比較中，差異無統計學意義(χ2=4.49，P>0.05；χ2=1.35，P>0.05)，見表3，圖4～圖6。

表1 兩組一般臨床資料比較

表2 兩組eNOS 894G/T位點基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

表3 兩組eNOS 4b/4a位點基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Mraker:1～4:4個不同樣本的eNOS 894G/T位點的PCR反應產物電泳條帶，目的片段為248 bp

M：Marker;1～4:TT(248 bp)、GG(163、85 bp)、GT(248、163、85)

圖3 eNOS 894G/T位點片段基因測序圖

1、3、5:bb基因型(420 bp)；2:ab基因型(420、393 bp)；4:aa基因型(393 bp)

圖5 eNOS 4b/4a 4a片段基因測序圖

圖6 eNOS 4b/4a 4b片段基因測序圖

3 討 論

eNOS基因位于人類染色體7q35-q36區，由跨越21 kb的26個外顯子和25個內含子構成，編碼含有4 052個核苷的mRNA，eNOS主要分布在血管內皮細胞、血管組織和血小板等，與心腦血管疾病密切相關。目前已發現十幾種eNOS基因的多態性位點，如894G/T、27A/C、786T/C、922A/G、4b/4a等。其中研究主要集中在894G/T位點和4b/4a位點〔4～7,9,10〕。

位于eNOS基因的第7外顯子894位堿基由G到T的突變，可以導致密碼子298位的谷氨酸轉變為天門冬氨酸，從而改變eNOS酶的活性，進而導致NO的生物活性下降，NO的生成量減少〔11,12〕。近年來，關于eNOS 894G/T位點多態性的研究較多，Nien-Tsung等〔6〕研究表明eNOS 894G/T位點多態性與心血管病存在相關性，心血管病組T等位基因頻率明顯高于對照組。另有研究證實eNOS 894G/T多態性是高血壓的危險因素〔4，5〕，還與頸動脈斑塊的產生相關，是頸動脈粥樣硬化和缺血性腦卒中的危險因素〔7〕。

上述疾病均與VCI的發病相關，但目前關于eNOS 894G/T位點多態性與VCI關系的報道較少。Morris等〔9〕研究表明，eNOS 894G/T位點的TT基因型可以增加卒中后癡呆的發病風險，T等位基因可能是其易感基因。本研究結果顯示：VCI組含T等位基因的頻率明顯高于對照組，因此，我們認為T等位基因可能是VCI的易感基因，突變純合子TT基因型的出現會增加VCI的遺傳易感性。這與國內江意春等〔10〕的研究結果相一致。

Gabrille等〔13〕認為VCI理想的易感基因具備以下兩點：(1)與高血壓、頸動脈粥樣硬化等血管性疾病相關的基因。(2)直接影響腦對血管疾病反應如缺血耐受性和神經可塑性等的基因。我們的研究進一步經高血壓分層后發現，在高血壓(-)的亞組中，VCI組含T等位基因的頻率亦明顯高于對照組；而在高血壓(-)亞組中，不存在此種差異，提示eNOS 894G/T位點多態性對VCI的影響與高血壓相關。目前關于VCI的發病機制仍不明，既往研究多認為其發病機制與長期慢性腦的低灌注以及缺血再灌注有關〔14〕。我們的研究結果提示：eNOS894G/T位點的突變導致eNOS的功能受損,產生的NO減少, 影響血管內皮功能，引起血管緊張性增高而導致高血壓。而長期的高血壓加速了動脈粥樣硬化的進展，血管阻力增加，腦血流減少，使大腦處于長期慢性的低灌注狀態，最終影響認知功能。

位于eNOS基因第4內含子基因數目可變性串聯重復序列(VNTR)多態性位點，它是以27 bp為核心數目的可變性串聯重復序列(eNOS 4b/4a)，該位點的多態性同樣會影響eNOS酶的功能，以及NO的生物活性〔11〕。研究表明，eNOS 4b/4a位點多態性與冠心病〔15〕和高血壓〔5,16〕存在相關性，a等位基因是其易感基因。但是，在本研究人群中，VCI組含a等位基因的頻率雖然高于對照組，但是差異不具顯著性，可能與樣本量小，存在誤差有關，有待于擴大樣本進一步證實。

綜上所述，本研究發現VCI患者等位基因T頻率升高，G頻率降低，說明等位基因T可能是中國人VCI的危險因素之一。并且我們推測eNOS 894G/T位點多態性通過影響高血壓而間接影響認知功能。因此，對VCI的高危人群，進行eNOS基因型的檢測，以及良好的控制高血壓，可能在一定程度上預防VCI的發病。

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