全身振動對去卵巢大鼠骨組織血管內皮生長因子蛋白表達的影響

司會群 卜淑敏 趙俊勇 文思敏 段曉麗

(首都體育學院，北京 100191)

骨質疏松多發(fā)生于絕經后女性和老年男性〔1，2〕。雌激素替代療法是臨床治療絕經后骨質疏松的常用方法，在一定程度上能緩解骨質疏松癥狀，但也會給身體其他系統帶來不良反應，出現不可耐受的副作用。國內外已有很多關于非藥物療法預防及治療絕經后骨質疏松的研究。國外學者研究已證實，全身振動刺激可防治婦女絕經后骨質疏松〔3〕,但機制還不清楚。雖然研究表明血管內皮生長因子(VEGF)作為最有效的促血管生長因子參與骨形成和骨吸收過程〔4，5〕，但全身振動刺激在治療絕經后骨質疏松過程中是否影響骨組織VEGF蛋白的表達，目前筆者查閱文獻還未見報道。鑒此，本研究采用全身振動干預手段，觀察全身垂直振動刺激對去卵巢骨質疏松大鼠骨組織VEGF蛋白表達的影響，旨在為探討絕經后骨質疏松振動療法的作用機制提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 36只3月齡健康雌性未孕SD大鼠，體重(260±12)g，由北京維通利華實驗動物中心提供并飼養(yǎng)〔動物合格證號SCXK (京)2006-0008〕，標準嚙齒類動物飼料，自由飲水和進食，使用3R實驗動物原則給予人道關懷。

1.2動物手術與分組 大鼠適應飼養(yǎng)1 w后，按體重隨機分為假手術組(Sham,12只)，去卵巢組(24只)。各組大鼠在手術前均禁食12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉,去卵巢組從背部切除雙側卵巢,假手術組只切除卵巢旁與卵巢等大的一塊脂肪組織。無菌手術在北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部進行。術后自由飲水進食,1 w后按體重將去卵巢組大鼠隨機分為去卵巢靜止組(OVX,12只)和去卵巢振動組(WBV,12只)。在實驗進行過程中，2只DVX組大鼠因腹部粘連而死亡，最后納入實驗的各組大鼠數目分別為：假手術組12只，OVX組10只，WBV組12只。

1.3全身振動方案 手術后第10周，用XR-36型雙能X線骨密度儀(DEXA)檢測去卵巢兩組大鼠的腰椎骨密度，確定骨密度已經下降后，WBV組大鼠先在振動臺上適應性振動訓練1 w，1次/d，15 min/次,振動加速度為3.8 g，頻率為90 Hz，7次/w。從第11周開始進行正式全身振動，2次/d，振動頻率和加速度不變。所有振動實驗均在上午進行，正式振動處理時間為7 w。

1.4全身骨密度檢測 實驗結束時，按腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，麻醉后將大鼠俯臥在DEXA測量平臺上，在小動物模式下掃描各大鼠全身和主要部位骨密度。

1.5骨標本的采集 各組大鼠取材前均禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉后腹主動脈取血處死。根據大鼠解剖位置截取第3腰椎、股骨遠端和脛骨近端并剝離干凈，液氮凍存，用以提取總蛋白。

1.6Western 印跡檢測VEGF蛋白表達水平 將骨組織在液氮中迅速研磨成粉末，取200 g粉末加入1 ml含PMSF的組織裂解液靜置于冰上2 h，4℃，12 000 r/min離心30 min。取上清液與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)按照4∶1混合，沸水浴5 min后即刻放置在冰上冷卻，分裝后-40℃保存。取15 μl蛋白樣品上樣，在10%SDS-Page凝膠中電泳。電泳結束后，在80 V電壓下轉膜2 h，然后在質量分數為5%的脫脂奶粉液中封閉2 h，加一抗(Mouse-抗-VEGF;Rabbit-抗-β-actin,)4℃過夜；次日，將膜用TBST洗3次，10 min/次，加入TBST稀釋的二抗(馬抗小鼠IgG/磷酸酶標記和山羊抗兔IgG/磷酸酶標記)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，10 min/次；用BCIP/NBT化學顯色至出現條帶，蒸餾水終止顯色，拍照，用Quatity One軟件掃描各條帶灰度值后進行定量分析。

2 結果

2.1各組大鼠在體骨密度的比較 OVX組大鼠第5腰椎、股骨遠端和脛骨近端骨密度顯著低于sham組大鼠(P<0.01或P<0.001)，而全身骨密度無顯著性差異(P>0.05)；WBV組大鼠脛骨近端骨密度顯著高于OVX組(P<0.01)，而其他部位骨密度無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠在體骨密度的比較

2.2各組大鼠骨組織VEGF蛋白表達的比較 與Sham組比較，OVX組脛骨近端骨組織VEGF蛋白表達顯著下降(P<0.01)，而股骨遠端和腰椎無顯著性差異(P>0.05)；與OVX組比較，WBV組腰椎、股骨遠端和脛骨近端VEGF蛋白表達均顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

與Sham組比較：1)P<0.05;與OVX組比較：2)P<0.05;3)P<0.01

3 討論

近幾年來，運用物理療法來防治骨質疏松已成為研究熱點〔6，7〕。機械強度低于引起骨組織損傷的振動信號不僅可以防止骨丟失，還能改善骨結構，具有很強的促進骨形成的效應，是一種具有應用前景的治療骨質疏松的物理療法〔8〕。

前期實驗顯示，大鼠的腰椎和股骨松質骨骨密度在去卵巢8 w時會顯著降低〔9〕。本實驗表明骨質疏松模型建立成功。并且全身振動能部位依賴性地改善去卵巢骨質疏松大鼠的骨密度。Judex等〔10〕的研究結果與本研究結果一致。Rubinacci等〔12〕報道振動對脛骨和脊柱骨密度影響不同可能是因為脛骨和脊柱中雌激素受體分配不同引起。與本實驗研究結果類似，即振動刺激對脛骨骨密度的影響顯著大于對腰椎骨密度的影響，可能是振動刺激明顯增加了脛骨中雌激素受體的數量，從而顯著增加了骨密度。

VEGF作為體內最強的血管內皮生成因子，一方面通過血管化參與骨代謝，另一方面，VEGF還直接參與成骨和破骨作用，已被看作為一種骨代謝調節(jié)因子〔12，13〕。破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成間的偶聯促使骨量轉換處于動態(tài)變化中，血管的生成在此耦聯機制中起著關鍵作用〔14〕。Ichiro〔12〕研究發(fā)現，大鼠去勢后VEGF的表達減少，其結果與本實驗結果相似，結果提示，振動刺激可能是通過促進去卵巢骨質疏松大鼠骨組織VEGF蛋白的表達而刺激成骨細胞形成進而促進骨的重建。李鵬彪〔15〕研究發(fā)現，雌激素可促進成骨細胞VEGF的表達，潘晉平〔16〕研究也發(fā)現，適當濃度雌激素能促進成骨細胞VEGF的表達，說明VEGF是雌激素調節(jié)骨代謝的機制之一。至于振動是否通過雌激素促進去卵巢骨質疏松大鼠骨組織VEGF蛋白的表達還有待實驗進一步證實。

4 參考文獻

1China health promotion foundation white paper on osteoporosis in China〔J〕.Chin Health Manage,2009;3 (3): 148-54.

2Nochowitz B,Siegert S,Wasik M.An update on osteoporosis 〔J〕.Am J Ther,2009;16(5): 437-45.

3Verschueren SM,Roelants M,Delecluse C，etal.Effect of 6-month whole body vibration training on hip density,muscle strength,and postural control in postmenopausal women: a randomized controlled pilot study〔J〕.Bone Miner Res,2004;19(3):352-9.

4Kohno S,Kaku M,Kawata T,etal.Neutralizing effects of an anti-vaacular endothelial growth factor antibody on tooth movement〔J〕.Angle Orthod,2005；75(5):797-804.

5Zhang Q,Guo R.VEGF-C,a lymphatic growth factor,is a RANKL target an autocrine mechanism 〔J〕.J Biol Chem,2008;283:13491-9.

6陳建庭，鄧軒賡，馮 鷹，等.復合振動治療卵巢切除大鼠骨質疏松的初步試驗研究〔J〕.中國老年學雜志，2008；28(9)：842-4.

7Rubinacci AM，Arenzanz M，Cavani F,etal.Ovariectcmy sensitizes rat cortical bone to while-body vibration〔J〕.Calcif Tissue Int,2008;82(4):316-26.

8Jordan J.Good vibrations and strong bones〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2005;288(3):R555-6.

9Bitto A， Altavilla D，Bonaiuto A,etal.Effects of aglycone genistein in a rat experimental model of postmenopausal metabolic syndrome〔J〕.J Endocrinol,2009;200(3):367-76.

10Judex S,Lei X,Han D，etal.Low- magnitude mechanical signal that stimulate bone formation in the ovariectomized rat are dependent on the applied frequency but not on the stain magnitude〔J〕.Biomech,2007;40:1333-9.

11Rubinacci A,Marenzana M,Cavani F，etal.Ovariectomy sensitizes rat cortical bone to whole-body vibration〔J〕.Calcif Tissue Int,2008;82: 316-26.

12Ichiro K,Shumpei N,Mitsuhiro S,etal.Estrogen regulates the prodiction of VEGF for osteoclast formation and activity in op/op mice〔J〕.Joumal of Bone and Mineral Research,2004;2: 200.

13Maes C,Carmeliet P,Moermans K,etal.Impaired angiogenesis and endochondral bone formation in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188〔J〕.Mech Dev,2002;111(1-2):61-73.

14Cai DJ,Zhao Y,Glasier J,etal.Comparative effect of soy protein,soy isoflavones,and 17β-estradiol on bone metabolism in adult ovariectomized rats 〔J〕.Bone Miner Res,2005;20: 828-39.

15李鵬彪,尹蕓生等.雌激素對骨質疏松大鼠骨折愈合過程成骨細胞血管內皮生長因子表達的影響〔J〕.中國藥物與臨床，2010；10(8):321-3.

16潘晉平.雌激素對成骨細胞血管內皮生長因子表達的影響〔D〕.山西醫(yī)科大學，2010:3.