褪黑素對阿爾茨海默病小鼠模型鈣離子晝夜節律的調節作用及機制

梁一波 劉衍宇 鄧玉麗 張 衍 葉志東 羅 虹 關俊文

(湛江市第二人民醫院臨床時間醫學實驗室，廣東 湛江 524003)

阿爾茨海默病(AD)患者的腦組織常發生一系列病理改變，特別是海馬β-淀粉樣蛋白(Aβ)等自由基明顯增多，神經細胞變性、壞死，AD可以使機體的生物節律消失，其中靜息-活動近日節律的紊亂就是其中的一個具體表現〔1〕。褪黑素(MT) 是由大腦松果體分泌的一種神經內分泌激素,有抗腦細胞損傷作用,是神經細胞抗氧化作用較強的活性物質之一〔2〕，AD 病人腦脊液中MT水平低下，腦室壁和海馬Aβ沉積及鈣化斑形成等神經毒性作用可能是AD發病的重要途徑，MT可能通過對Aβ自由基的調控，發揮鈣子離對腦組織的保護作用〔3〕。本文探討MT對小鼠自主活動近日節律和認知能力的調節作用。

1 材料與方法

1.1儀器和試劑 DW-5腦立體定位儀、ZZ小鼠自主活動測試儀、200-Morris水迷宮購自四川成都泰盟科技有限公司、貝克曼LD20生化分析儀及上海科華生物制品公司試劑盒；Aβ1-42，Sigma 公司產品,用無菌生理鹽水將其溶解稀釋成1 μg/μl，放置于4℃冰箱備用。MT，Sigma 公司產品,臨用前用無水乙醇溶解,再加生理鹽水配制,乙醇終濃度為5%。

1.2實驗動物分組 BALB/c小鼠，體重(18±2) g,由廣東醫學院動物實驗中心供給。隨機分為3組，即AD模型組(AD組)、褪黑素調節組(MT組)、假手術組(NS組)，每組各24只。具體處理如下：①MT組：右側腦室注入Aβ1～422 μl，術后3 d再用MT 5 mg/kg腹腔注射連續10 d。②AD組：右側腦室注入Aβ1～422 μl，術后3 d再用等量5 %乙醇生理鹽水腹腔注射連續10 d。③NS組右側腦室注入人工腦脊液2 μl，術后3 d再用等量5%乙醇生理鹽水腹腔注射連續10 d。

1.3模型制作 用0.45%戊巴比妥鈉10 ml/kg麻醉小鼠，將其固定于腦立體定位儀上，頭頂部備皮、絡合碘消毒后切開小鼠顱頂皮膚，暴露顱骨，參照小鼠腦立體定位圖譜〔4〕，用牙科鉆鉆一小孔定位于右側腦室前囟點后1 mm，中線旁開2 mm處，深2.5 mm，通過腦立體定位儀與微量注射器緩慢注入Aβ1～422 μl留針5 min，術后常規飼養。

1.4標本制作 術后2 w進行行為學測驗，然后每組小鼠24 h內，每隔4 h隨機取出4只，摘眼球取血液分離血清，斷頭后迅速取腦組織勻漿高速離心取上清液，把血清和腦漿上清液編號-20℃保存待測。

1.5測定指標 ①自主活動節律分析：用ZZ小鼠自主活動測試儀，在全亮環境下自主飲食，每3 min記錄1次小鼠活動次數，共記錄7 d。②認知能力：采用Morris水迷宮測試認知能力。實驗前訓練3 d，先將小鼠置于水迷宮中自由游泳2 min，以適應水迷宮的環境，訓練2次/d，120 s/次，每次訓練間隔30 min，選擇平臺的對角象限中環入水，將小鼠面朝池壁放入水池，任其游泳直至找到平臺。正式實驗為1 d，每組小鼠連續24 h里每隔4 h測試1次，小鼠尋找平臺的時間和軌跡，由Morris水迷宮視頻跟蹤系統自動記錄各組小鼠逃避潛伏期及到達平臺全程，其數量大小與小鼠空間學習記憶成績負相關。③所有血清和腦漿上清液標本同批測定，用生化分析儀測定各組標本鈣離子濃度。

2 結 果

2.1MT對AD模型小鼠自主活動近日節律的調節 小鼠側腦室注Aβ1～42術后第14天，放入ZZ小鼠自主活動測試儀檢測各組小鼠的自主活動度。NS組小鼠自主活動近日節律明顯，AD模型組小鼠自主活動度近日節律消失，表明Aβ1～42對小鼠的活動度有顯著的影響，使其靜息-活動的近日節律紊亂，MT組小鼠的近日節律再現，只是時相有變,提示MT可改善Aβ1～42所致AD小鼠的自主活動近日節律。見圖1。

2.2MT對AD模型小鼠空間學習記憶能力的調節 用Morris水迷宮視頻跟蹤系統檢測各組小鼠1 d的6個時點(0：00、4：00、8：00、12：00、16：00、20：00)的空間學習記憶能力變化趨勢。NS組與MT組空間學習記憶能力的平均潛伏期晝夜變化均呈明顯波動結構，存在近日節律,且潛伏期短；而AD組平均潛伏期變化幾乎平直，近日節律消失。組間兩因素方差分析,AD組小鼠平均潛伏期較NS組與MT組顯著延長(P<0.01)，上述結果提示，AD組小鼠學習記憶能力差；MT可顯著改善AD模型小鼠學習記憶近日節律。見表1。

2.3MT對AD模型小鼠血清及腦室鈣含量的調節 在行為檢測結束后,3組小鼠在一天6個時點(0：00、4：00、8：00、12：00、16：00、20：00、22：00)，各組隨機抽4個小鼠摘眼球取血液并立即斷頭取腦勻漿離心，取上清液用生化分析儀測定鈣的含量，結果NS組小鼠與MT組小鼠血清及腦鈣離子濃度晝夜變化存在近日節律，AD組小鼠近日節律消失。與NS組和MT組比較,AD組小鼠各時點血清鈣顯著下降(P<0.01)，腦組織鈣顯著上升(P<0.01) 。NS組與MT組12：00、16：00時點血清鈣和8：00、12：00、20：00時點腦漿鈣水平比較無統計學意義(P>0.05)，表明Aβ1～42可誘發大腦組織鈣化增加；MT對Aβ1～42誘發大腦組織鈣化有對抗作用。見表2。

圖1 各組小鼠第7天自主活動直方圖

與MT組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

表2 各組小鼠血清和腦漿晝夜6個不同時點鈣濃度

3 討 論

生物節律是許多生物體固有的以晝夜周期性變化為基礎的一種生命屬性，其中以近日節律最為顯著，某些疾病發生、發展與生物節律變化密切相關。已有實驗證明Aβ是各種原因誘發AD的共同通路，AD加速松果體的退行性變，加重松果體的鈣化程度，松果體的細胞也顯著減少，這些病理改變均可影響機體的生物節律〔5〕。MT是體內最強的自由基清除劑，具有對抗Aβ神經毒性作用，MT能抑制氧自由基鏈式反應、保護細胞脂質膜的完整性，從而維持細胞內鈣調節系統的平衡，避免因為細胞內的鈣超載而造成的細胞死亡〔3〕。作為第二信使，鈣離子控制許多生理過程。靜息狀態下胞漿中Ca2+水平很低，細胞內外的Ca2+濃度差大，Ca2+可通過胞漿上的Ca2+通道或胞內Ca2+庫的釋放通道提高胞漿中Ca2+濃度，從而引起各種生理活動〔6〕。Ruthrich等〔7〕用摘除松果體制作AD小鼠模型，結果顯示海馬Ca2+濃度異常增高，同時伴有小鼠海馬神經元凋亡增多，從而證實松果體的主要激素MT可抑制細胞內Ca2+的升高提出Ca2+可能參與了AD患者神經元細胞死亡過程，他們發現過多的Ca2+進入神經元會導致細胞死亡。

本研究采用Aβ注入腦室制作AD小鼠模型并以MT干預，結果表明，Aβ與嗜神經細胞依賴性鈣離子受體結合引發Ca2+內流，最終導致神經元功能障礙， AD小鼠模型晝夜活動近日節律消失。MT能明顯減少AD小鼠的異常活動，并顯著改善神經元損害造成的自主活動和學習記憶能力近日節律，MT組與AD組相比學習記憶能力明顯改善，近日節律再現，其機制可能是MT抑制腦細胞Ca2+內流以發揮抗AD作用。

4 參考文獻

1Gormanl MR,Yellon S.Lifespan daily locomotor activity rhythms in a mouse model of amyloid-induced neuropathology〔J〕.Chronobiol Int,2010;27(6)：59-77.

2Reiter RJ.Melatonin：an antioxidant in edible plants〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2002;957:341-4.

3Chen P. Electrosprayionization tandem mass spectrometry in high-through put screening of homogeneous catalysts〔J〕.Angew Chem Int Ed Eng1,2003;42(25):2832-47.

4Keith BJ，Franklin GP.The mouse brain in stereotaxic coordinates〔M〕. USA：Academic Press，1997：35.

5Brunner P，Szer-Topcular N,Jockers R,etal.Pineal and cortical melatonin receptors MT1and MT2 are decreased in Alzheimer′s disease〔J〕.Eur J Histochem，2006;50(4):311-6.

6Kishiyama MM，Yonelinas AP，Lazzara MM，etal.The von Restorff effect in amnesia：the contribution of the hippocampal system to novelty- related memory enhancements〔J〕.J Cogn Neurosci,2004;16(1):15-23.

7Ruthrich HL，Krug M.Conditioning hypoxia causes protection against ischemia in the CA 1-region of hippocampal slices〔J〕.Restor Neurol Neurosci,1999;15(4):327-35.