MMP-2基因多態性與河南漢族群體慢性充血性心力衰竭的相關性

殷國田 趙林靜 黃艷梅 郭利偉 張新寧 李征輝 李 娜

(新鄉醫學院基礎醫學院，河南 新鄉 453003)

基質金屬蛋白酶(MMPs)是鋅依賴性蛋白酶家族，能降解細胞外基質蛋白，參與結締組織破壞與重構。許多研究證實無論心力衰竭動物或人類，MMP基因表達和酶活性都是增高的，并且是心室重構和擴張的重要觸發因素，而并非繼發于心力衰竭〔1～3〕。MMP-2的表達及活性過度增強時，可能參與心臟組織及脈管系統的重構，從而引起心血管系統損害，最終導致心功能惡化乃至心衰〔4～6〕。本項目研究了MMP-2基因啟動子區-1575G/A、-1059G/A、-790G/T 3個單核苷酸多態性(SNPs)位點，并探討其與河南漢族群體慢性充血性心力衰竭(CHF)發病的相關性。

1 材料與方法

1.1研究對象 選擇河南省新鄉醫學院第三附屬醫院心血管內科2010年12月至2011年12月收治的120例CHF患者作為病例組(心衰組)。其中男72例，女48例，年齡58～79〔平均(62.1±10.5)〕歲。與心衰組同期住院的非心衰心臟病患者，共收集136例，其中男78例，女58例，年齡46～78〔平均年齡(60.7±8.8)〕歲，亦排除血液疾病、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全等疾病。所有入選對象均簽署知情同意書。

1.2主要儀器與試劑 多功能電泳儀(Phannacia公司，瑞典)、凝膠成像分析系統(Bio-Rad公司，美國)、UV-1240核酸蛋白分光光度計(島津公司，日本)、臺式高速冷凍離心機(Eppendorf公司，德國)、PCR儀(Biometra公司，德國)Taq 酶 (上海生物工程有限公司)、MMP-2基因SNPs位點擴增引物 (Invitrogen生物公司上海英濰捷基貿易有限公司)、限制性內切酶Hha Ⅰ、BspH Ⅰ、Ade Ⅰ(西班牙MBI生物公司)。

1.3研究方法

1.3.1資料收集 所有入選對象均由經統一培訓的住院醫師、研究生填寫自制統一格式的調查表，然后由2名監督員對每1份調查表進行檢查、審核，有錯誤者補充漏項、糾正錯誤。

1.3.2生化指標測定 受試者經10 h過夜空腹，取凌晨6：00空腹靜脈血8 ml，其中3 ml用于血脂等生化指標測定、5 ml用于外周血白細胞的DNA提取。血生化指標檢測由新鄉醫學院第三附屬醫院檢驗科采用現行標準化方法完成并統一進行質量控制。

1.3.3基因組DNA的提取與定量 采用常規酚/氯仿法提取血樣中的基因組DNA，采用UV-260紫外分光光度儀(日本島津公司)計檢測DNA的質與量，-20℃保存備用。

1.3.4SNPs目的片段擴增 PCR反應體系：總體積為25 μl，含10×緩沖液 2.5 μl、25 mmol/L Mg2+1.5 μl、2 mol/L dNTP 1 μl、10 mmol/L Primers 2 μl、Taq DNA 聚合酶1 U、基因組DNA(10～100 ng)3 μl、ddH2O 14.6 μl。 熱循環參數94℃預變性2 min，94℃變性30 s，退火45 s(各SNPs引物序列及退火溫度見表1)，72℃延伸45 s，36個循環，最后72℃延伸10 min。

表1 MMP-2基因3個SNPs位點擴增引物序列、退火溫度及限制性內切酶

1.3.5SNPs等位基因分型 對PCR產物進行酶切，采用限制性內切酶片段長度多態性(PCR-RFLP)方法鑒定SNPs的等位基因及基因型，各SNPs所用限制性內切酶見表1。酶切反應體系為：PCR產物5.0 μl，內切酶1 U，10×酶切緩沖液1.0 μl，純水補足總體積至10 μl，37℃水浴10 h；酶切產物取3.0 μl上樣，用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行檢測，恒壓200 v，1 h，電泳同時加入100 bp DNA Marker以及PCR擴增產物(未酶切)做內參。

1.4統計學方法 將各組基因型及等位基因輸入Excel表格，采用病例對照分析并運用SHEsis軟件〔7〕進行病例與對照組間頻數及頻率分布比較、HarDY-Weinberg平衡檢驗、單體型推斷、相對危險度(OR)及95%置信區間(CI)計算。

2 結 果

2.1一般特征 兩組患者性別構成及年齡無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，心衰組血尿酸(UA)水平明顯升高，吸煙比例以及各項血脂水平都顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.2MMP-2基因上3個SNPs與CHF的相關性

2.2.1PCR-RFLP結果及基因型分析 MMP-2-1575G/A、-1059G/A、-790G/T 3個SNPs位點引入的酶切位點及內切酶見表3。根據電泳出現條帶判定基因型。各位點等位基因電泳圖譜如圖1，實際操作中以帶型集中區照相判讀。

表2 兩組一般情況比較

2.2.2兩組各SNPs等位基因和基因型頻率分布 MMP-2-1575G/A、-1059G/A、-790G/T 3個SNPs位點的等位基因及基因型頻率在CHF和對照人群中均符合HarDY-Weinberg平衡(P>0.05)。MMP-2基因-1575G/A、-1059G/A、-790G/T 3個SNPs多態性與CHF的相關性如表4、表5所示。與對照組相比，CHF組MMP-2-1575G/A的A等位基因和GA基因型的頻率顯著降低(P<0.001)，OR=0.08〔95%CI(0.019～0.039)〕<1。MMP-2-790G/T的T等位基因頻率顯著增加(P<0.001)，OR=1.989〔95%CI(1.337～2.959)〕>1；TT基因型頻率與對照組相比也顯著增加(P<0.05)。MMP-2-1059G/A SNP位點等位基因與基因型頻率在兩組間差異沒有統計學意義(P>0.05)，OR=1.129〔95%CI(0.772～1.651)〕。

表3 MMP-2基因3個SNPs位點等位基因判斷及內切酶

2.2.3MMP-2單體型分析 用SHEsis軟件統計分析，推斷出MMP-2基因-1575G/A、-1059G/A和-790G/T 3個SNPs位點在CHF組和對照組分別有7種、6種單體型，其中單體型GAG、GAT、GGG、和GGT在CHF組和對照組頻率均(P>0.01)。進一步對4種頻率>l%的單體型兩組間進行比較，GGG和GGT單體型的頻率在CHF組和對照組中存在顯著差異(P<0.01)，其中GGT單體型OR=1.802〔95%CI(1.265～2.569)〕>1。見表6。

M：DNA Marker；1、2、3、5、6、7、8、9、10：GG；4：GA M：DNA Marker；1、2、3、8：GA；4、5、6、7：GG；9：AA M：DNA Marker；1、2、4、5：GT；3、6：TT；7、8：GG

表4MMP-2基因3個SNPs位點在兩組中等位基因和基因型頻率分布〔n(%)〕

1)P<0.001；2)P<0.05；下表同

表5 MMP-2基因3個SNPs位點在兩組中等位基因頻率分布及OR值

表6 MMP-2基因3個SNPs位點在兩組中等位基因和基因型頻率分布

3 討 論

心力衰竭的病理生理機制主要與心肌重構和神經-內分泌系統的激活兩大因素有關，細胞外基質(ECM)在心肌重構中的作用已得到公認。MMPs對降解ECM有重要作用，近年研究表明，MMPs的表達及活性增強參與許多心血管疾病的發展過程〔8〕。

MMP-2在內皮細胞、成纖維細胞、心肌細胞等大部分結締組織細胞中都有基礎表達，有研究發現MMP-2水平與心力衰竭過程中的左室擴張和功能不全有關。實驗室研究也證實MMP-2活性升高與心肌缺血再灌注損傷中的心肌頓抑有關，并可以直接損傷心肌收縮力〔9〕。某些MMP-2亞型基因啟動子區的多態性可以影響到轉錄因子與這一區域的結合，進而影響整個轉錄效率。已有研究證實MMP-2啟動子區多態性位點與心力衰竭存在相關性〔2，9〕。本研究提示A等位基因可能降低個體CHF危險。基因功能研究提示MMP-2 -1575G/A位點處于雌激素受體結合位點的5′側，-1575G表現出增強子的功能，而-1575A轉錄活性顯著降低。因此，MMP-2- 1575G等位基因可以增加MMP-2的表達，進而產生破壞ECM、心肌頓抑和直接損害心肌肌原纖維的作用，1575A等位基因則降低MMP-2轉錄活性，減少表達，減輕了上述不良影響，因而降低了收縮性心力衰竭的易感性〔10〕。

在河南漢族群體中，兩組比較，MMP-2啟動子-790G/T 的T等位基因頻率顯著增加。本研究結果與Vasku等〔11〕研究發現，在CHF的患者中，MMP-2 -790T/G的T等位基因頻率顯著增加一致，說明MMP-2-790G/T 的T等位基因頻率顯著增加可能會增加個體CHF的患病風險。用SHEsis軟件統計分析，推斷出MMP-2基因-1575G/A、-1059G/A和-790G/T 3個SNPs位點的單體型GAG、GAT、GGG、和GGT在心衰組和對照組頻率均>0.01，其中GGG和GGT單體型的頻率在病例和對照組中存在顯著差異(P<0.05)， GGT單體型OR值>1，說明GGT單體型可能增加CHF的危險性。

本研究結果表明，在河南漢族人群中，MMP-2基因1575G/A 位點A等位基因可能會降低CHF的患病風險；MMP-2-790G/T 的T等位基因以及MMP-2基因啟動子區-1575 G/A、-1059G/A、-790G/T位點所組成的GGT單體型都可能增加CHF的患病風險；而MMP-2基因-1059G/A多態性在河南漢族人群中可能與CHF的易感性無關。

4 參考文獻

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