金雀異黃素誘導K562和K562/ADM細胞的凋亡作用

劉 潤 郭 超 趙 英

(甘肅中醫學院解剖教研室，甘肅 蘭州 730000)

植物雌激素金雀異黃素(GS)是國內外公認的植物界抗癌成分的首選物質,其具有抑制多種腫瘤細胞生長、誘導多種來源腫瘤細胞凋亡的作用〔1，2〕。這主要與它的弱雌激素作用和抗雌激素樣作用、抑制生長因子受體酪氨酸激酶活性、誘導細胞凋亡、干擾細胞周期等〔3〕有關，但其作用機制尚未完全闡明。腫瘤細胞發生凋亡抑制是腫瘤產生多藥耐藥的核心和本質，應用藥物誘導腫瘤細胞凋亡已成為治療腫瘤及耐藥逆轉的新途徑〔4〕。本課題探討GS誘導K562和K562/ADM細胞凋亡通路的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1試劑 GS，純度98%，用無水乙醇配成1×104μmol/L的貯存液，MTT、瓊脂糖、溴乙啶(EB)、碘丙啶(PI)均為美國Sigma公司產品；DNA抽提試劑盒購自上海生工生物公司；鼠抗人Bcl-2單抗(即用型)、兔抗人Bax單抗(即用型)、免疫組化試劑盒均購自福州邁新生物公司。

1.2細胞培養 K562和K562/ADM細胞株由蘭州大學醫學實驗中心提供。細胞接種于含15%新生小牛血清的RPMI 1 640培養液中，置37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養。定期加入阿霉素(3～6 g/ml)以維持其耐藥性，去除阿霉素后繼續培養2 w后用于實驗。實驗時均采用對數生長期細胞，實驗中乙醇的最大終濃度為0.1%。

1.3MTT比色法 把細胞制成單細胞懸液，以密度1×104/ ml 200 μl /孔接種于96孔培養板中，對照組不加藥，實驗組在不同濃度的GS作用24、48、72 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，繼續孵育4 h，棄上清，加入150 μl DMSO，充分溶解結晶物，在酶標儀上于570 nm處測定吸光度值，計算細胞生長抑制率和IC50。

1.4流式細胞儀(FCM)分析細胞凋亡 各組收集處理48 h 2×106個細胞，PBS洗滌。制成單細胞懸液，70%冷乙醇固定過夜，PBS洗滌，PI染色，上機檢測。

1.5親和素-生物素-酶復合物(ABC)法觀察Bcl-2和Bax蛋白表達 各組收集處理48 h 1×106個細胞，PBS洗滌,在細胞涂片離心機的樣品容器中每孔加200 μl細胞懸液涂片(800 r/min,4 min)，丙酮固定。采用親和素-生物素-酶復合物法(ABC),嚴格按試劑盒操作程序操作，DAB顯色。PBS代替一抗設陰性對照。顯色時鏡下控制。脫水、透明、封片。結果判定：以胞核、胞質棕黃染色且背景清晰者為陽性信號，陽性細胞數≥25%為陽性。

2 結 果

2.1GS對細胞增殖的生長抑制作用 GS對K562及K562/ADM細胞增殖有明顯抑制作用，對K562及K562/ADM細胞的生長抑制率與濃度呈正相關，GS對K562/ADM細胞的耐藥倍數為1.67倍，說明K562/ADM細胞株是多藥耐藥表型的細胞系，提示K562細胞對GS比K562/ADM細胞敏感，K562/ADM細胞對GS同樣存在耐藥現象。見表1。

2.2FCM檢測細胞凋亡 GS作用K562細胞，細胞凋亡率有時間與濃度依賴性，可見亞G1期細胞增多，GS 75 μmol/L時為27.3%，高于GS同濃度下作用K562/ADM細胞時的5.4%(P<0.05)，說明GS更易誘導K562細胞凋亡；S期細胞減少，G2M期細胞增多，提示細胞發生G2M期阻滯。而 GS作用K562/ADM細胞，細胞組間凋亡率沒有明顯變化，但細胞發生明顯的G2M期阻滯。見表2。

2.3Bcl-2和Bax蛋白的免疫細胞化學檢測結果 結果顯示，不同濃度GS對K562細胞的Bax蛋白呈強陽性表達率100%，對照組幾乎不著色；Bcl-2蛋白實驗組同對照組比較顏色無明顯變化；而在K562/ADM細胞中，Bcl-2在實驗組和對照組中均強表達，但Bax的表達均無明顯變化(圖1、圖2)。

表1 GS對K562細胞及K562/ADM細胞增殖的生長抑制作用

表2 GS對K562和K562/ADM細胞周期分布的影響

圖1 各組K562細胞Bax蛋白表達(DAB,48 h,×400)

圖2 各組K562/ADM細胞Bcl-2蛋白表達(DAB,48 h,×400)

3 討 論

白血病細胞發生耐藥的信號途徑及調控機制仍不甚明了，凋亡抑制是白血病細胞耐藥形成的重要機制之一〔5〕，凋亡調控蛋白Bcl-2和Bax是同一家族作用完全相反的蛋白，兩者之間表達量的平衡關系決定細胞的生存或凋亡。Bcl-2是廣義的抑制凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，Bax/Bcl-2異二聚體或Bax/Bax同二聚體增高，將導致細胞凋亡〔6〕。細胞Bcl-2蛋白表達水平與腫瘤細胞對多種化療藥物敏感性和耐受性密切相關。本研究觀察到K562/ADM細胞高表達Bcl-2蛋白，GS并不能誘導K562/ADM細胞Bcl-2蛋白表達發生明顯變化，提示K562/ADM細胞的耐藥性和凋亡抑制與Bcl-2蛋白高表達有關。GS通過上調Bax蛋白的表達量，下調Bcl-2蛋白的表達量，從而誘導K562細胞凋亡。本實驗中，通過GS對白血病細胞的生長抑制和誘導凋亡作用，說明GS可作用于細胞周期信號系統，干擾細胞周期時相的協調進行，形成K562細胞對GS比K562/ADM細胞敏感，K562/ADM細胞對GS同樣存在耐藥的現象，提示GS主要通過生長抑制、干擾細胞周期、誘導細胞凋亡的方式抑制白血病細胞的增殖。GS作用的機制有助于臨床克服抗腫瘤藥物的耐藥性提供新的途徑。

4 參考文獻

1Kousidou OC,Mitropoulou TN,Roussidis AE,etal.Genistein suppress the invasive potential of human breast cancer cells through transcriptional regulation of metalloproteinases and their tissue inhibitors〔J〕.Int J Oncol,2005;26(4)：1101-9.

2鐘興蘭，王新娟，姚偉娟，等.金雀異黃素對小鼠紅白血病細胞系MEL的抑制作用〔J〕.中國生物化學與分子生物學報，2003；19(1)：112-7.

3范玉貞,王玉華.金雀異黃素抗腫瘤作用的研究進展〔J〕.實用腫瘤學雜志,2008；22(1)：72-5.

4Johnstone RW，Ruefli AA，Lowe SW.Apoptosis：a link between cancer genetics and chemotherapy〔J〕.Cell Biochem，2002；108(2):153-64.

5Gadducci A，Cosio S，Muraca S，etal.Molecular mechanisms of apoptosis and chemsensitivity to platinum and paclitaxel in ovarian cancer：biological and clinical implications〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2002；23(5):390-6.

6Yang LJ,Wang WL.Establishment of the hepatoma cells which express Bax protein Stably and highly and observation of its apoptotic phenomena〔J〕.J Fourth Mil Med Univ,2002；23(5):455-8.