絲膠對2型糖尿病大鼠下丘腦神經(jīng)肽Y和瘦素表達(dá)的影響

付秀美 和亞強(qiáng) 鐘美蓉 付文亮 陳志宏 薛景鳳

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000)

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病，近年來發(fā)病率逐年上升。研究表明，神經(jīng)肽Y(NPY)在下丘腦合成后通過軸突輸送到下丘腦弓狀核，經(jīng)弓狀核分泌而參與攝食及能量代謝的調(diào)節(jié)，可刺激多飲多食，特別是對碳水化合物的采食〔1〕。下丘腦NPY分泌失調(diào)必然導(dǎo)致糖代謝紊亂。瘦素(Leptin)可作用于下丘腦，通過影響攝食中樞而調(diào)節(jié)NPY的表達(dá)，影響機(jī)體能量代謝和體脂平衡。有關(guān)研究表明Leptin異常出現(xiàn)在2型糖尿病之前，可能是導(dǎo)致胰島素抵抗及2型糖尿病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因子〔2〕。本研究采用連續(xù)小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立2型糖尿病動物模型，觀察絲膠對下丘腦NPY和Leptin mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 STZ購于美國Sigma公司，臨用時(shí)用pH4.4的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配成2%的溶液。絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡，水煎，過濾，濃縮而成。血糖檢測試劑盒，保定長城試劑有限公司，批號：20072030； Trizol 購自美國Invitrogen公司，NPY和Leptin引物由上海生工公司合成，一步法RT-PCR 試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，50 bp DNA Ladder 購自石家莊市勃盛化學(xué)試劑有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性SD大鼠48只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號：712024)，體質(zhì)量200～250 g。將大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、絲膠組和二甲雙胍組，每組12 只大鼠。模型組、絲膠組和二甲雙胍組大鼠均采用2%STZ(25 mg/kg，3 d)連續(xù)腹腔注射建立糖尿病動物模型，以血糖≥16.7 mmol/L 作為成模標(biāo)準(zhǔn)。待模型成功建立后，模型組大鼠不再做任何處理；絲膠組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d，二甲雙胍組大鼠給予二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃35 d。

1.3檢測血糖 大鼠取血前禁食12 h 以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血，3 000 r/min 離心20 min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4RT-PCR法檢測各組大鼠下丘腦NPY和Leptin mRNA的表達(dá) 大鼠取血后斷頭處死，迅速取出全腦后投入液氮中冷凍。NPY引物大小為155 bp，上游引物序列：5′-ATACTACTCCGCTCTGCGACA-3′，下游引物序列：5′-ATCACCACATGGAAGGGTCTT -3′；瘦素引物大小為332 bp，上游引物序列：5′-TGGCATTGCCTGGAGCGCAG-3′，下游引物序列：5′-GTGGGGCCCTCACTCCCTGA -3′；β-actin 引物大小為445 bp，上游引物序列：5′-GAGGGAA ATCG TGCGTGAC-3′,下游引物序列：5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。待檢測時(shí)用直徑2.5 mm的套管刀在冰凍大鼠腦腹側(cè)視交叉后方打孔取下丘腦，組織柱長約5 mm，迅速稱重(約30 mg)并將其勻漿，取100 mg在液氮中碾磨成粉末，按Trizol 總RNA 抽提說明書操作，提取下丘腦的總RNA。取5 μl RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的28 S、18 S和5 S三條完整的條帶，說明抽提的總RNA比較完整；紫外分光光度計(jì)檢測OD260/OD280值為1.9～2.1，說明RNA沒有被污染。取3 μg總RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：30℃，10min；55 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min。NPY PCR 反應(yīng)條件：94℃，2 min；94℃，30 s；50℃～65 ℃，30 s；72℃，1 min，第二步起循環(huán)。Leptin的PCR反應(yīng)條件為：94℃，2 min；94℃，30 s；50 ℃～65 ℃，30 s；72 ℃，1 min，第二步起循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mg/L Goldview)，采用ZF 型紫外透射反射分析儀攝像，并用Quantity One-4.6.2 軟件進(jìn)行定量分析，以目的條帶光密度與β-actin 條帶光密度的比值，作為目的基因mRNA表達(dá)的相對水平。

2 結(jié) 果

2.1血糖 模型組大鼠的血糖為(29.45±4.82) mmol/L，正常組大鼠的血糖為(10.83±2.03) mmol/L，可見模型大鼠的血糖明顯高于正常大鼠(P<0.01)。絲膠組和二甲雙胍組大鼠的血糖分別為(13.20±4.09) mmol/L，(13.18±2.30)mmol/L，均明顯低于模型大鼠(P<0.01)，表明絲膠可明顯降低糖尿病大鼠的血糖，且作用與二甲雙胍相當(dāng)(P>0.05)。

2.2各組大鼠下丘腦NPY和Leptin mRNA的表達(dá) 糖尿病模型組大鼠下丘腦NPY和Leptin mRNA的表達(dá)均明顯高于正常大鼠(P<0.01)；絲膠可明顯下調(diào)糖尿病大鼠下丘腦NPY和Leptin mRNA的表達(dá)，絲膠組大鼠下丘腦NPY和Leptin mRNA的表達(dá)均明顯低于模型組大鼠(P<0.05)；且作用與二甲雙胍相當(dāng)(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠下丘腦NPY和Leptin mRNA的表達(dá)

3 討 論

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病，目前全世界大約有1.5億患者，據(jù)專家估計(jì)，這個(gè)數(shù)字將會在15年后突破3億。因此探討糖尿病的發(fā)病機(jī)制，從而減少或者阻斷糖尿病的發(fā)生發(fā)展，就成為亟待解決的問題。

NPY是一個(gè)強(qiáng)烈的食欲刺激因子，是主要營養(yǎng)物質(zhì)的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，廣泛的分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周血液循環(huán)中。在對STZ致糖尿病大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，下丘腦NPY明顯增多，認(rèn)為NPY參與多飲、多食、生長發(fā)育遲緩等病理生理過程，并與糖尿病自主神經(jīng)病變、血管病變、腎臟病變及糖尿病視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥有關(guān)〔3〕。向正常大鼠腦室灌注NPY會出現(xiàn)多食、肥胖、高胰島素血癥等與2型糖尿病相似的特征〔4〕。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠下丘腦NPY基因表達(dá)明顯增加，因此我們推斷糖尿病的發(fā)生可能與下丘腦NPY轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平的增加有關(guān)。在正常情況下，下丘腦NPY水平增加，一方面促進(jìn)食欲；另一方面，NPY可降低交感神經(jīng)對棕色脂肪的作用，使機(jī)體產(chǎn)熱減少，同時(shí)增加白色脂肪組織內(nèi)與脂類合成有關(guān)的酶類的表達(dá)，使體脂儲存增加，體重上升〔5〕。由于NPY對交感神經(jīng)的作用發(fā)生障礙，加上胰島素的絕對或相對不足，嚴(yán)重影響糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝。這可能是糖尿病中樞損傷的機(jī)制之一，雖然NPY是否是糖尿病的致病因素還未成定論，但對NPY與糖尿病關(guān)系的研究將有助于加深對糖尿病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，并有望為糖尿病治療提供新方法。

Leptin是一種由脂肪細(xì)胞合成、分泌的“脂肪調(diào)節(jié)激素”，可通過與下丘腦內(nèi)特異受體結(jié)合來減少NPY的表達(dá)，從而減少攝食、增加能量消耗、改善胰島素抵抗〔6〕。糖尿病時(shí)Leptin信號傳導(dǎo)通路受阻，作用下降，循環(huán)中Leptin水平過高，形成Leptin抵抗，從而引起一系列代謝綜合征，Leptin主要通過MAPK通路和PI3-K、Akt通路對胰島細(xì)胞分泌胰島素素進(jìn)行調(diào)節(jié)：通過PI3-K途徑激活KATP通道，使β細(xì)胞超極化，阻止Ca2+內(nèi)流，胞漿中Ca2+濃度下降，從而阻止了胰島素的分泌；還可通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活PI3-K依賴性的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶3B、cAMP降解酶，從而降低cAMP，抑制胰島素的分泌〔7〕。研究表明大多數(shù)糖尿病者患者血液中Leptin水平明顯增高，且Leptin水平與2型糖尿病的空腹胰島素、C肽水平顯著相關(guān)〔8〕。Leptin信號系統(tǒng)改變能影響2型糖尿病的發(fā)展及血清胰島素水平〔9〕。但是，對于Leptin在組織中的研究卻少之又少。本研究采用RT-PCR法觀察下丘腦內(nèi)Leptin mRNA含量的變化，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠Leptin mRNA含量呈現(xiàn)增高的趨勢，致使Leptin信號傳導(dǎo)通路受阻，導(dǎo)致下丘腦NPY分泌增加，從而導(dǎo)致導(dǎo)致或者加重糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。

起源于我國的蠶絲業(yè)擁有幾千年的悠久歷史，以往對蠶絲的應(yīng)用主要集中于絲素，約占繭絲30%的絲膠作為廢料而遭到遺棄。絲膠是具有多種生物活性的蛋白質(zhì)，其中的氨基酸以絲氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等為主，目前對絲膠的研究主要集中在美容、護(hù)膚、營養(yǎng)與保健等方面；本課題組的前期研究結(jié)果表明絲膠能顯著的降低血糖并對糖尿病時(shí)胰腺、腎臟、睪丸、海馬等器官損傷有明顯的保護(hù)作用。本研究顯示，絲膠可下調(diào)NPY mRNA的表達(dá)，改善NPY高表達(dá)所誘發(fā)的脂肪堆積和胰島素抵抗，同時(shí)絲膠也可下調(diào)Leptin mRNA的表達(dá)，進(jìn)而減輕Leptin高表達(dá)對NPY的刺激作用，并且，絲膠下調(diào)NPY和Leptin的作用與二甲雙胍相當(dāng)。而絲膠是天然的蛋白質(zhì)，避免了化學(xué)合成藥物引起的毒副作用，因此具有良好的推廣應(yīng)用前景。

4 參考文獻(xiàn)

1李寧川，顏文錦，王金玉.運(yùn)動訓(xùn)練對糖尿病大鼠糖代謝和下丘腦神經(jīng)肽Y mRNA的影響〔J〕.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2008；27(1)：52-4.

2Lilja M，Rolandsson O，Norberg M,etal.The impact of leptin and adiponectin on incident type 2 diabetes is modified by sex and insulin resistance〔J〕.Metab Syndr Relat Disord，2012；10(2):143-51.

3Sk?rstrand H,Dahlin LB,Lernmark A,etal.Neuropeptide Y autoantibodies in patients with long-term type 1 and type 2 diabetes and neuropathy〔J〕.J Diabetes Complications,2013;27(6):609-17.

4Bruinstroop E，Pei L，Ackermans MT,etal.Hypothalamic neuropeptide Y (NPY) controls hepatic VLDL-triglyceride secretion in rats via the sympathetic nervous system〔J〕.Diabetes,2012；61(5):1043-50.

5Vella KR，Ramadoss P，Lam FS,etal.NPY and MC4R signaling regulate thyroid hormone levels during fasting through both central and peripheral pathways〔J〕.Cell Metab,2011；4(6):780-90.

6任 艷，李秀鈞，田浩明，等.2型糖尿病家系正常糖耐量一級親屬血清瘦素、腫瘤壞死因子-α、神經(jīng)肽Y水平及與胰島素抵抗、β細(xì)胞分泌功能相關(guān)性的臨床研究〔J〕.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2010；27(6)：1341-5.(6):1341-5.

7王麗紅，陳諾琦.瘦素的生物學(xué)效應(yīng)及與糖尿病的聯(lián)系〔J〕.中國實(shí)用醫(yī)藥，2010；5(19)：239-41.

8Katsiki N，Mikhailidis DP，Gotzamani-Psarrakou A,etal.Effect of various treatments on leptin，adiponectin，ghrelin and neuropeptide Y in patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Expert Opin Ther Targets,2011；15(4):401-20.

9Dalvi PS，Erbiceanu FD，Irwin DM,etal.Direct regulation of the proglucagon gene by insulin，leptin，and cAMP in embryonic versus adult hypothalamic neurons〔J〕.Mol Endocrinol，2012； 26(8)：1339-55.