金屬硫蛋白3對快速老化癡呆模型小鼠海馬組織學變化的影響

馬飛煜 林 婉 黃林歡 林 麒

(汕頭市中心醫院暨中山大學附屬汕頭醫院神經內科，廣東 汕頭 515041)

海馬結構在學習、記憶等高級神經活動中起重要作用。阿爾茨海默病(AD)主要累及于此，表現為進行性智力衰退和行為、人格變化?？焖倮匣V呆模型小鼠(SAMP8)是主要以學習、記憶能力下降為特征的比較理想的自然衰老癡呆模型〔1～4〕?？焖倮匣∈?SAMR1)表現為正常衰老，一般作為SAMP的正常對照〔5〕。Uchida等〔6〕首次從人腦組織中分離出金屬硫蛋白(MT)3，因其只在腦內特異表達，可能具有重要的神經生理和神經調節功能。臨床報道老年癡呆患者腦內MT3含量明顯減少〔7〕，引發了許多MT3與AD發病機制的研究。本實驗觀察MT3對SAMP8小鼠海馬組織學變化的影響。

1 材料與方法

1.1動物分組 實驗動物均7月齡，雄性，每組20只。SAMP8作為癡呆組，SAMR1作為正常組。將SAMP8隨機分成癡呆組、空白對照組(0.2 ml/10 g生理鹽水)、低濃度MT3(75 μg/ml)組、中濃度MT3(150 μg/ml)組、高濃度MT3(300 μg/ml)組。由天津中醫學院第一附屬醫院實驗動物中心提供。連續腹腔注射28 d，停藥1 d后備用。

1.2光鏡標本制備、HE染色 4%多聚甲醛灌注取腦，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明后，浸蠟，石蠟包埋制成蠟塊，每只鼠海馬連續發片；切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇脫水：蘇木精染色；鹽酸乙醇分化；自來水浸泡；置伊紅液；常規脫水，透明，封片。

1.3透射電鏡標本制備 用2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液灌注取腦，再置于4%戊二醛、鋨酸中固定；梯度酒精脫水；環氧樹脂包埋；制備半薄切片定位后，超薄切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染，備電鏡觀察。

2 結 果

2.1各組小鼠海馬CA1區HE染色結果 SAMP8組海馬CA1區結構不清，錐體細胞數量減少，排列紊亂；很多細胞核體積變小、深染，呈核固縮表現；膠質細胞明顯增生。SAMR1組海馬CA1區結構清晰，錐體細胞數量未見減少，細胞排列較整齊、均勻，細胞形態正常，結構完整。低、中、高濃度MT3組海馬CA1區錐體細胞較空白對照組結構較清晰，排列較整齊均勻，膠質細胞減少；中濃度MT3組有錐體細胞脫失；低、中濃度MT3組形態學不如高濃度MT3組規整；高濃度MT3組海馬CA1區錐體細胞排列較整齊均勻，細胞形態結構較清晰(圖1)。

2.2各組小鼠海馬CA1區神經元透射電鏡超微結構結果 SAMP8組大部分神經元體積變小，核不規則，胞質內有較多脂褐素沉積；出現胞核固縮，核膜斷裂，線粒體空泡化，有脂褐素沉積；神經氈呈空泡化，神經絲溶解消失；核基輕度空化，胞質內可見線粒體，粗面內質網及脂褐素。SAMR1組神經元胞膜完整，染色質分布均勻，細胞器清晰可見，排列有序，細胞核呈圓形或橢圓形，核仁清楚，單個或兩個；神經氈超微結構正常。低、中、高濃度MT3組均可見神經元輕度空泡化改變，胞質內都可見線粒體和粗面內質網稍腫脹，脂褐素沉積；神經氈內空泡化減少，神經絲較空白對照組增多；高濃度MT3組可見接近正常神經元，有少量脂褐素，神經氈、神經絲較空白對照組增多。海馬CA1區超微結構受損逐漸減輕，高濃度MT3組最接近于SAMR1組，但仍未達到正常(圖2)。

圖1 各組海馬CA1區錐體細胞排列比較(HE，×400)

圖2 各組海馬CA1區神經元透射電鏡超微結構

3 討 論

AD主要病理變化包括神經元缺失，老年斑形成，神經原纖維纏結及神經膠質細胞增生。海馬結構在學習、記憶等高級神經活動中起重要作用。SAMP8是由日本京都大學Takeda教授開發，以學習記憶功能呈增齡性加速衰退為主要特征，成為研究老化和學習記憶障礙的理想動物模型〔8，9〕。本實驗說明SAMP8學習記憶能力下降與海馬結構神經元減少、變性和凋亡有關。SAMP8經MT3治療能減輕海馬神經元的損傷，對神經元起到保護作用。MT3只存在于中樞神經系統，對其生物學功能的認識，目前概括起來包括以下幾個方面：①對銅、鋅等金屬的隔離與分散作用；②調控鋅金屬蛋白的生物合成及活性；③保護細胞免受自由基傷害；④特定情況下對神經元細胞生長的抑制作用。本實驗結果證實SAMP8學習記憶能力下降有其海馬結構的組織形態學基礎，MT3能通過對海馬神經元的保護作用而起到改善認知功能。目前MT3對AD的保護作用機制尚未清楚。

4 參考文獻

1Okuma Y，Nomura Y.Senescence-accelerated mouse (SAM) as an animal model of senile dementia：pharmacological，neurochemical and molecular biological approach〔J〕.Jpn J Pharmacol，1998；78：399-404.

2Nomura Y，Okuma Y.Age-related defect s in lifespan and learning ability in SAMP8 mice〔J〕.Neurobiol Aging，1999；20：111-5.

3Han S，Rudd JA，Hu ZY，etal.Fang M.Analysis of neuronal nitric oxide synthase expression and increasing astrogliosis in the brain of senescence-accelerated-prone 8 mice〔J〕.Int J Neurosci，2010；120(9)：602-8.

4Fernández-Gómez FJ，Muoz-Delgado E，Montenegro MF，etal. Cholinesterase activity in brain of senescence-accelerated-resistant mouse SAMR1 and its variation in brain of senescence-accelerated-prone mouse SAMP8〔J〕.J Neurosci Res，2010；88(1)：155-66.

5Takeda T.Senescence-accelerated mouse (SAM)：a biogerontological resource in aging research〔J〕.Neurobiol Aging，1999；20(2)：105-10.

6Uchida Y，Takio K，Titani K.The growth inhibitory factor that is deficient in Alzhemler’s disease is a 68 amino acid metallothionein-like protein〔J〕.Neuron，1991；7(2)：337-47.

7Yu WH，Lukiw WJ，Bergeron C，etal.Metallothionein is reduced in Alzheimer’s disease〔J〕.Brain Res，2001；894：37-45.

8Okuma Y，Nomura Y.Senescence-accelerated mouse(SAM) as an animal model of senile dementia：pharmacological，neurochemical and molecular biological approach〔J〕.Jpn J Pharmacol，1998；78：399-404.

9劉一凡，石學敏，韓景獻，等.快速老化腦萎縮模型小鼠腦抗氧化酶活性增齡性變化的研究〔J〕.中國老年學雜志，2003；23：462-3.