自噬在貝伐單抗誘導非小細胞肺癌凋亡中的作用

朱 礫 楊 洋 劉東雷 郭海周 趙 松

(鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌發病率占肺癌總發病率的80%。肺癌起病隱襲、早期診斷率低，大多數患者在確診時已達中晚期，失去了外科治療的最佳時機。貝伐單抗是重組人血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體，相關試驗已證明貝伐單抗對于肝細胞移植瘤以及鼻咽癌移植瘤的新生血管生成及細胞生長具有抑制作用〔1,2〕。本試驗將自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)引入，進一步探討自噬在貝伐單抗非小細胞肺癌A549細胞的增殖抑制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 非小細胞肺癌細胞株A549由河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室提供。貝伐單抗(阿瓦斯汀)購自瑞士羅氏制藥公司。3-MA、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、單丹磺酰尸胺(MDC)及吖啶橙(AO)為美國Sigma公司產品。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒由南京凱基生物科技發展有限公司生產。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液購自Solarbio公司。微管相關蛋白(LC)-3及Beclin1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2試驗方法

1.2.1MTT法定性檢測細胞存活與生長 用含10%胎小牛血清加1640培養基將A549細胞分散成單個細胞懸液，以每孔5 000～10 000個細胞接種到96孔板，體積100 μl/孔，按5%CO2，37℃孵育，至細胞貼壁，加入濃度梯度的藥物，每個濃度設6個復孔，100 μl/孔,作用24～48 h。 每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續培養4 h。每孔加150 μl DMSO，脫色搖床振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.2流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數生長期細胞，以5×105個/ml接種于6孔板中，待細胞貼壁后加入相應濃度藥物，設立陰性對照組并作用24 h。收集懸浮細胞，用不含EDTA胰蛋白酶消化液消化收集貼壁細胞，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入400 μl AnnexinV結合液懸浮細胞，使細胞濃度調整為1×106個/ml，在細胞懸液中加入5 μl AnnexinV-FITC染色液，混勻，4℃避光孵育15 min，再加10 μ PI，混勻，4℃避光孵育5 min，立即上流式細胞儀檢測。每組實驗重復4次。

1.2.3AO及MDC染色檢測細胞自噬情況 將處于對數生長期的A549細胞，以5×105個/ml濃度接種于24孔板中，待細胞貼壁后，采用所測得最適實驗濃度的貝伐單抗和3-MA處理細胞，同時設立陰性對照組，作用24 h后棄培養液，PBS洗滌2次,加濃度為50 μmol/L的MDC(或10 μg/ml的AO)在5%CO2，37℃下染色45 min，棄染液，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛在4℃下固定15 min，后用PBS洗滌3次，立即用倒置熒光顯微鏡觀察細胞自噬的變化情況并攝片。

1.2.4Western 印跡檢測細胞Beclin1和LC-3蛋白的表達 選擇處于對數生長期的A549細胞若干培養瓶，設置實驗組：單用貝伐單抗，單用3-MA及聯用組，并設置空白對照組。分別加入實驗濃度藥物，培養24 h。同時收集瓶中和培養液中的細胞，經預冷PBS洗滌后，每瓶細胞加入裂解液,經離心后分裝入EP管中。應用考馬斯亮藍，通過測定吸光度值進行蛋白質定量。配置好分離膠及濃縮膠，每孔上樣15 μl，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。半干轉膜法轉膜，并用5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入Beclin1及LC-3抗體(濃度均為1∶500)4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，10 min/次，辣根過氧化物酶標記二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST再次洗滌4次，10 min/次，進行ECL化學發光，暗室內X膠片曝光顯影并攝片。β-actin為內參照。

2 結 果

2.1MTT結果 隨著貝伐單抗及3-MA濃度的增加，對A549細胞的抑制率也增加、貝伐單抗作用48 h時，細胞IC50值約為20 μmol/L，因此選用20 μmol/L作為貝伐單抗實驗劑量；3-MA作用48 h時，A549細胞IC10值約為10 mmol/L,故選用10 mmol/L作為3-MA實驗劑量。

2.2細胞凋亡情況 流式細胞儀檢測示，單用貝伐單抗組細胞凋亡率為(21.82±0.41)%，3-MA組細胞凋亡率為(3.54±0.11)%，二者與對照組(0.92±0.26)%相比，差異均具有統計學意義(均P<0.05)。聯合用藥組細胞凋亡率較單用貝伐單抗組和3-MA組均有增加，為(36.76±0.87)%(均P<0.05)。

2.3AO及MDC檢測細胞自噬情況 用熒光染料AO染色，檢測細胞質內酸性膜泡的變化，發現胞質及胞核周圍出現紅色斑點酸性囊泡。單用貝伐單抗組出現較多自噬空泡，說明貝伐單抗可誘導細胞出現自噬現象；而3-MA組幾乎未見自噬空泡；對照組及聯用組出現自噬空泡數多于3-MA組，而少于貝伐單抗組，說明3-MA在一定程度上可以抑制貝伐單抗誘導的細胞自噬。見圖1。MDC多聚集在自噬空泡中，在細胞核周圍可見藍綠色或黃綠色點狀結構。單用貝伐單抗組A549細胞可見細胞中出現大量自噬空泡，說明該組細胞明顯發生自噬。而單用3-MA組細胞未見明顯自噬空泡，貝伐單抗與3-MA聯合組較單用貝伐單抗組細胞相比，自噬空泡有所減少。說明3-MA可以一定程度上抑制貝伐單抗誘導的細胞自噬。見圖2。

圖1 AO檢測細胞自噬情況(×400)

圖2 MDC檢測細胞自噬情況(×400)

2.4Western 印跡結果 貝伐單抗組Beclin1及LC-3表達較對照組均明顯增加，而貝伐單抗與3-MA聯合作用組中兩種蛋白的表達較單用貝伐單抗組明顯減少。MG132作用后，半胱氨酸蛋白酶(Caspase-9)的表達明顯增加，而加入3-MA聯合作用后，其表達較單用MG132明顯增加。見圖3。

圖3 Western 印跡檢測結果

3 討 論

抗腫瘤血管治療是目前抗腫瘤治療的熱點，在正常組織中，血管或脈管系統的生成是受到嚴格調控的，但是，研究表明在大多數人類腫瘤中VEGF表達均上調。血管的生成涉及到血管內皮細胞和其分泌的配體以及各種生長因子之間復雜的相互作用。其中，VEGF是介導血管生成最關鍵的因子之一。貝伐單抗是一種重組的人類單克隆IgG1抗體，通過抑制人類血管VEGF的生物學活性而起作用。

近年來，自噬作為Ⅱ型程序性死亡已經越來越受到人們的重視。在自噬發生的早期，自噬可作為一種保護機制，使腫瘤細胞避免受到低營養、電離輻射和化療等所致的損傷而持續生存；而當外部環境較差，腫瘤細胞過度自我吞噬效應時，就會引起自噬性死亡(Ⅱ型程序性死亡)，從而抑制腫瘤的發生、發展〔3〕。作為抗腫瘤血管生成藥物，貝伐單抗可能存在刺激細胞過度自噬而抑制腫瘤細胞生長，甚至促進其死亡的作用。另據研究〔4〕表明，3-MA作為特異性抑制自噬后通過激活凋亡特異性蛋白Caspase-3誘導肺癌細胞啟動程序性細胞死亡。

LC-3是哺乳動物細胞中酵母ATG8(Aut7/Ap98)基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。LC-3有Ⅰ型和Ⅱ型之分。自噬發生時，Ⅰ型LC-3經泛素樣加工修飾過程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結合，形成Ⅱ型LC-3。LC-3Ⅱ結合并始終位于胞內自噬體的膜上。其含量的多少與自噬泡數量的多少成正比〔5〕。因此LC-3的表達強度與自噬活性密切相關。

本試驗AO及MDC后經光學顯微鏡下觀察，均得出貝伐單抗有較弱的促進A549細胞的凋亡作用，其機制可能為使腫瘤細胞過度自噬引起自噬性死亡；且與自噬抑制劑3-MA聯用時，較單用貝伐單抗有更強的促細胞凋亡的作用。最后通過蛋白免疫印跡雜交檢測微管相關蛋白LC-3及自噬相關蛋白beclin-1的表達變化，再次驗證貝伐單抗的促進A549細胞自噬及凋亡的作用。

4 參考文獻

1GuoXL,Li D，Sun K，etal.Inhibition of autophagy enhances anticancer effects of bevacizumab in hepatocarcinoma〔J〕.J Mol Med，2013；9(4)：473-83.

2孫婷婷， 徐江平.貝伐單抗對耐藥鼻咽癌細胞凋亡的影響〔J〕.解放軍醫學雜志，2008；33(12)：1438-40.

3Mathew R,Karantza-wadsworth V,White E.Role of autophagy in caner〔J〕.Nat Rev Cancer,2007；7(12):961-7.

4朱良綱， 杭均彪， 杜海磊，等.自噬在吉西他濱誘導肺癌細胞A549凋亡中的作用及其相關機制〔J〕.中國腫瘤臨床，2012；39(10)：652-5.

5Mizushima N.Methods for monitoring autophagy〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2004；36(12)：2491-502.