鏈脲佐菌素誘導的胰島素缺乏對APP/PS1轉基因小鼠腦內tau蛋白磷酸化的影響

王 旭 高素杰

(遼寧中醫藥大學組胚教研室，遼寧 沈陽 110847)

近年流行病學資料顯示，與正常人群相比，阿爾茨海默病(AD)患者腦脊液中胰島素水平明顯下降，并伴有腦內胰島素信號轉導通路障礙〔1〕。同時也有研究發現AD患者腦中胰島素基因表達減少, 提示腦中胰島素的含量減低可能與AD發病有直接關系〔2，3〕。但關于腦內胰島素的缺乏加重AD的發病和發展的機制尚不明確。本研究將采用AD轉基因小鼠腹腔內注射STZ制備胰島素缺乏合并AD的動物模型，觀察腦組織內tau蛋白磷酸化改變。

1 材料與方法

1.1實驗動物 取3月齡健康雄性APP/PS1轉基因小鼠16只，分為兩組，每組8只，其中一組APP/PS1轉基因小鼠腹腔內注射鏈脲佐菌素(STZ) (Sigma公司)，使用前0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液新鮮配置，劑量為90 mg/kg，連續2 d。另一組作為對照組，注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。7 d后自尾靜脈采血，用便攜式血糖測定儀 (美國，強生) 測定血糖水平，隨機血糖持續大于15 mmol/L者符合糖尿病標準，表明造模成功。動物精心飼養20 w，每周監測體重和血糖的變化。

1.2小鼠腦組織取材 動物飼養第20周，各組小鼠麻醉后斷頭，迅速取出大腦放冰盤上，從中間矢狀縫切開，一半放入4%多聚甲醛中固定，常規制備石蠟切片，用于免疫組織化學染色；另一半-80 ℃保存備用，供Western 印跡使用。

1.3Western 印跡 取APP/PS1轉基因小鼠大腦皮層，按1∶5比例加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4 ℃裂解過夜，4 ℃ 12 000 r/min低溫離心30 min，取上清，考馬斯亮藍法進行蛋白定量。按50 μg蛋白上樣，用10%聚丙烯酰胺分離膠，將蛋白質提取物分離，再將其轉印到硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉室溫下封閉 1 h后，分別加入鼠抗phosph-tau (Thr231) 抗體 (Invitrogen公司), 兔抗phosph-tau (Thr205) 抗體、兔抗phosph-tau (Ser396)，兔抗tau (Abcam公司) 4 ℃過夜。TBST洗后加入辣根過氧化物酶標記羊/鼠抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，ECL顯色，圖像分析。

1.4免疫組化染色 石蠟包埋組織切片常規脫蠟至水，以3%H2O2滅活內源性過氧化物酶。PBS液沖洗后，檸檬酸/鹽緩沖液中微波修復抗原，正常山羊血清封閉液室溫孵育30 min，甩去多余液體，滴加適當稀釋的兔抗phospho-tau (Thr489) 抗體 (Beijing Boisynthesis Biotechnology)，4 ℃過夜。滴加生物素標記的二抗室溫下孵育1 h，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育1 h。DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水，透明，封片，光鏡下觀察。以上各步驟均用PBS液沖洗，同時另用PBS代替一抗作為陰性對照。

2 結 果

2.1Western 印跡法檢測p-tau和tau的表達 Western印跡實驗方法檢測三個位點tau蛋白 (Thr205、Thr231和Ser396) 的表達 (圖1)，結果顯示：在Thr205位點上兩組實驗小鼠腦內tau蛋白磷酸化水平比較無顯著性差異(0.358±0.047 vs 0.411±0.036,P>0.05)；與對照組比較，STZ組tau蛋白在位點Thr231(0.622±0.083 vs 1.178±0.092)和Ser396(0.449±0.068 vs 1.304±0.108)上的磷酸化程度顯著增高(P<0.01)；兩組實驗小鼠腦內總tau蛋白的表達增高無顯著差異(0.590±0.068 vs 0.645±0.071，P>0.05)。

圖1 STZ致APP/PS1轉基因小鼠腦內多位點tau蛋白過度磷酸化

2.2免疫組化檢測p-tau的表達 在STZ組皮層神經元的核周區胞質中出現大量的棕黃色p-tau陽性表達顆粒，在同一區域內對照組胞質中僅見極少量棕黃色顆粒。STZ組p-tau陽性細胞免疫反應強度高于對照組(0.036±0.006 vs 0.109±0.012，P<0.05)。見圖2。

對照組 STZ組

3 討 論

AD的主要病理特征是腦內淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑 (SP) 和神經元內出現神經原纖維纏結 (NFTs)。胰島素是由胰島β細胞分泌的一種蛋白質類激素，其主要功能是降低血糖。研究發現腦內存在胰島素和胰島素受體 (IR)。腦內的胰島素可以由外周血中胰島素通過血腦屏障入腦，同時腦內的部分神經元也能夠合成和分泌胰島素〔4,5〕。近年來，大量流行病學和臨床研究發現腦中胰島素的含量減低可能與AD發病有直接關系〔2,3〕，給予胰島素治療可使AD癥狀減輕〔6〕。本實驗前期研究已經發現胰島素缺乏可使APP/PS1轉基因小鼠的AD癥狀加重，其機制是通過增強了APP向淀粉樣斑塊沉積形成通路的代謝，從而使Aβ的分泌大大增多〔7〕。但胰島素缺乏是否也能引起tau蛋白過度磷酸化從而使AD癥狀加重的研究并未進行，而且國內尚未見報道。

Tau蛋白是一種重要的小分子微管相關蛋白，其作用為促進微管組裝和穩定微管，其促微管活性與磷酸化狀態密切相關，過度磷酸化的tau蛋白是NFTs的主要組成部分，是AD病理改變中重要的標記性蛋白，與AD的發病有著不可分割的聯系〔8〕。有研究表明胰島素的功能障礙與tau蛋白的異常磷酸化有著密切的關系。Freude等〔9〕通過注射胰島素使外周血液中胰島素濃度增高，結果發現腦內tau蛋白Ser202位點磷酸化。另外，這項研究也報道了在胰島素受體缺乏的轉基因小鼠模型中，由于胰島素信號轉導系統發生障礙從而導致腦內tau蛋白的過度磷酸化。Clodfelder-Miller等〔10〕研究也發現，向小鼠腹腔內注射STZ誘導產生胰島素缺乏可導致小鼠腦內多個位點的tau蛋白過度磷酸化。

本研究研究結果發現在STZ組的APP/PS1轉基因小鼠腦內所檢測的Thr231、Ser396位點tau蛋白發生過度磷酸化改變。胰島素缺乏能導致tau蛋白過度磷酸化，從而加重AD發病。

4 參考文獻

1Gasparini L,Netzer WJ,Greengard P,etal. Does insulin dysfunction play a role in Alzheimer's disease〔J〕. Trends Pharmacol Sci, 2002; 23(6):288-93.

2Brands AM,Kessels RP,de Haan EH,etal. Cerebral dysfunction in type 1 diabetes: Effects of insulin,vascular risk factors and blood-glucose levels〔J〕. Eur J Pharmacol,2004; 490(1-3):159-68.

3de la Monte SM,Wands JR. Molecular indices of oxidative stress and mitochondrial dysfunction occur early and often progress with severity of alzheimer's disease〔J〕. J Alzheimers Dis,2006; 9(2): 167-81.

4Craft S,Watson GS. Insulin and neurodegenerative disease: Shared and specific mechanisms〔J〕. Lancet Neurol,2004; 3(3): 169-78.

5Baskin DG,Figlewicz DP,Woods SC,etal. Insulin in the brain〔J〕. Annu Rev Physiol,1987; 49: 335-47.

6Park CR,Seeley RJ,Craft S,etal. Intracerebroventricular insulin enhances memory in a passive-avoidance task〔J〕. Physiol Behav,2000; 68(4): 509-14.

7Wang X,Zheng W,Xie JW,etal. Insulin deficiency exacerbates cerebral amyloidosis and behavioral deficits in an Alzheimer transgenic mouse model〔J〕. Mol Neurodegener,2010; 5: 46-58.

8Janson J,Soeller WC,Roche PC,etal. Spontaneous diabetes mellitus in transgenic mice expressing human islet amyloid polypeptide〔J〕. Proc Natl Acad Sci U S A,1996; 93: 7283-8.

9Freude S,Plum L,Schnitker J,etal.Peripheral hyperinsulinemia promotes tauphosphorylation in vivo〔J〕.Diabetes,2005;54(12):3343-8.

10Clodfelder-Miller BJ,Zmijewska AA,Johnson GV,etal.Tau is hyperphosphorylated at multiple site in mouse brain in vivo after streptozotocin induced insulin deficiency〔J〕.Diabetes,2006;55(12):3320-5.