DcR3在預防博萊霉素大鼠模型發生肺纖維化中的作用

楊 洋 任 錦 劉 晶 馬忠森

(天津市胸科醫院，天津 130051)

肺纖維化一般指在毒物、自發免疫反應、藥物副反應、感染、嚴重的外傷等不同因素刺激下引起肺部炎癥反應，肺泡持續性損傷、細胞外基質反復破壞、修復、重建并過度沉積，導致正常肺組織結構改變、功能喪失的一類疾病，發病率逐年升高。肺纖維化的發生通常經歷肺泡炎和肺纖維化形成兩個階段，如果炎癥階段得到有效的抑制，勢必延緩或阻止肺纖維化的形成。但現有的抗炎藥物不能阻止肺纖維化的發展，有的甚至在抗炎的同時反而加重了肺纖維化的程度 。而近年來，DcR3在抗炎方面的研究備受關注，DcR3可能成為一個連接炎癥、 固有免疫、 腫瘤的中間點〔1〕。本文將采用DcR3蛋白尾靜脈注射干預肺纖維化早期動物模型，觀察其對炎癥反應的作用及其在預防纖維化方面的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雌性健康Wistar大鼠72只，平均體重250～300 g，購自吉林大學基礎醫學院動物中心，隨機分為三組，每組24只，分別為博萊霉素組、博萊霉素+ DcR3組、正常對照組。博萊霉素(日本化藥株式會社生產)；DcR3蛋白(Sigma 美國)；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒購自晶美生物公司；OligodT、禽成髓細胞增生疾病毒(AMV)逆轉錄酶購自Promega公司；TRIZOL、焦碳酸二乙酯(DEPC)、氯仿、異丙醇、dNTP、Taq DNA聚合酶購自大連寶生物公司。

1.2方法

1.2.1動物模型的制作與分組 以3%戊巴比妥鈉(0.4 ml/100 g體重)腹腔內注射麻醉，博萊霉素溶液(1.375 mg/ml)按5 mg/kg經氣管呈45°角注入大鼠肺內，左右來回旋轉并按摩雙肺10余次，使藥液盡可能在雙肺內均勻分布，手術后置于動物實驗室內喂養，分籠飼養，標記號分組。同樣方法，正常對照組推注等容積的生理鹽水。正常對照組大鼠活潑好動，體格隨飼養時間延長更加肥碩，皮毛光澤發亮，呼吸平穩。博萊霉素組造模后3 d開始出現動作緩慢、呼吸急促、進食少；隨著時間的延長出現精神萎靡、喜蜷縮、體重明顯下降、皮毛色澤晦暗無光，死亡率較高。博萊霉素+DcR3組大鼠在造模后3～7 d也出現動作緩慢、呼吸急促，進食少但隨著注射DcR3，情況改善，2 w后活動明顯增多、進食恢復、呼吸恢復，體重逐漸增長，4 w后與正常對照組無明顯區別。正常對照組：自模型制作當天開始每天給予尾靜脈注射1 ml生理鹽水；博萊霉素組：自模型制作當天開始每天給予尾靜脈注射1 ml生理鹽水；博萊霉素+ DcR3組：自造模當天開始按3.33 μg /kg 給予DcR3蛋白(1 μg/μl)1 ml，1次/d，尾靜脈注射，給藥時間2 w。

1.2.2標本制備 各組分別于2、4、6、8 w處死大鼠6只：大鼠稱重后以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，結扎左支氣管，分4次共注入磷酸鹽緩沖液(PBS) 6 ml邊按摩胸部邊回收液體，離心1 500 r/min 10 min，收集上清凍存待檢測TNF-α；重懸細胞計數并立即用于RT-PCR檢測TNF-α mRNA的表達。取左肺組織凍存留作羥脯氨酸檢測；取右肺組織浸入10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋、切片以備用組織染色。

1.2.3肺泡灌洗液細胞計數 用吸管吸5滴細胞懸液到離心管中，將細胞懸液滴入計數板：統計4個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的4個大格(每個大格含有16個中格)中的細胞數目。

1.2.4肺泡灌洗液中TNF-α mRNA及上清中含量的檢測 將重懸后BALF細胞轉移EP管中離心，去上清加入1 ml Trizol，提取RNA，測定RNA濃度：加99 μl三蒸水混勻稀釋，美國惠普可見/紫外光光度儀比色測OD值，A260/280在1.8～2.0之間。總RNA濃度(μg/ml)=OD 260×40×稀釋倍數。選取比值在2.0左右的RNA樣本做逆轉錄。逆轉錄反應體系：1 μl DEPC水、1 μl引物加入10 μl模板RNA→稍離心，100℃沸水1 min→加入2 μl dNTP Mix、4 μl 5×buffer、2 μl AMV逆轉錄酶→稍離心，42℃水浴90 min→沸水3 min 滅活AMV→-20℃保存或立即PCR。PCR反應體系：在0.3 ml PCR管，依次加入下列試劑：cDNA 5 μl、上游引物(10 pmol/L)1.5 μl、下游引物(10 pmol/L)1.5 μl、dNTP(2 mmol/L) 4 μl、10×PCR緩沖液5 μl Taq酶(2 U/μl)0.3 μl、ddH2O 32.7 μl，使總體積達50 μl→輕輕混勻、稍離心→設定PCR程序：94℃45 s，58℃45 s，72℃ 1 min，72℃延伸8 min，30個循環。引物：TNF-α(1 480 bp) 上游引物 5′-acagaaagcatgattccgaga-3′，下游引物 5′-tcagtagacagaagagcgtgg-3′；β-actin (570 bp) 上游引物 5′- acggcattgtcaccaactg -3′，下游引物5′- gcagctcatagctcttctc-3′。采用Tannon GIS凝膠電泳圖像分析儀進行密度掃描、結果分析、計算目的基因相對表達水平。收集各組不同時期肺泡灌洗液上清，-20℃凍存，統一采用晶美的ELISA試劑盒，按照試劑盒操作說明檢測TNF-α含量。

1.2.5組織標本染色 取石蠟切片，60℃烤2 h，二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水后，常規蘇木素-伊紅(HE)染色、Masson三聯染色。觀察肺組織病理學改變。參照Szapiel〔2〕方法確定肺泡炎和肺纖維化程度。即將肺泡炎分為4級：①無肺泡炎(-) 0分；②輕度肺泡炎(+)1分：單核細胞浸潤使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的20%，肺泡結構正常；③中度肺泡炎() 2分：受累面積占全肺的20%～50%近胸膜部較重；④重度肺泡炎() 3分：面積>50%，偶見肺泡腔內有單核細胞及出血造成的實變。肺纖維化同樣進行評分：①無肺纖維化(-) 0分；②輕度肺纖維化(+) 1分：受累面積<20%；③中度肺纖維化() 2分：受累面積20%～50%；(4)重度肺纖維化() 3分：受累面積>50%，肺泡結構紊亂。

1.2.6羥脯氨酸含量測定 肺組織加0.8 ml冰冷的PBS進行研磨，然后用0.2 ml預冷的PBS沖洗玻璃研磨管，一并倒入玻璃試管中。然后用南京建成羥脯氨酸檢測試劑盒(堿水解法)檢測羥脯氨酸含量。羥脯氨酸含量(μg/ml)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×標準管含量(5 μg/ml)×稀釋倍數。

2 結 果

2.1肺組織大體形態及組織病理變化 (1)正常對照組：各時相點肺組織均呈粉紅色，表面光滑均勻，無出血水腫等病理改變。肺泡炎的程度在各個時間點無明顯變化。(2)博萊霉素組：肺泡炎的程度在2 w時表現最重，有明顯的充血、水腫、出血點增多、部分融合成片；4 w時可見局部陳舊性出血點，肺表面不光滑，雙肺體積可縮小、蒼白，出現小結節，肺硬度增加；6 w時雙肺體積縮小，表面布滿結節，肺臟較硬，雙肺周邊可見致密的灰白或黃褐色纖維組織，近中央部分病變較輕，僅有輕度異常；2～6 w時炎癥程度均高于對照組(均P<0.05)，8 w時雙肺較6 w無明顯改變。(3)博萊霉素+DcR3組：2 w時可見充血水腫、出血點；4 w時雙肺顏色粉紅，個別雙肺周邊可見白色結節；6 w時雙肺較軟，顏色粉紅，僅在雙肺周邊見少量散在結節；8 w時雙肺改變基本同6 w。博萊霉素+DcR3組肺泡炎的程度表現為逐漸減輕的過程，2～6 w時炎癥程度均低于博萊霉素組(均P<0.05)，各時間點與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)；8 w時三組炎癥嚴重程度無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

對照組肺纖維化程度在各個時間點無明顯變化；博萊霉素組肺纖維化程度逐漸加重，各時間點與對照組比較均具有顯著性差異(P<0.05)；博萊霉素+DcR3組肺纖維化程度無明顯加重趨勢，4～8 w時與對照組比較差異顯著(P<0.05)，2～4 w肺纖維程度與博萊霉素組無明顯差異(P>0.05)，6～8 w肺纖維程度與博萊霉素組比較有顯著性差異(P<0.01)。見表2。

2.2不同實驗組、不同時期BALF細胞計數的變化 對照組BALF細胞總數波動在6～7×106/ml；博萊霉素組高于對照組，尤其在2～4 w細胞總數差異顯著(P<0.01)，6～8 w與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)；博萊霉素+DcR3組BALF細胞總數在2 w時最高，此后下降明顯，到第8周時反而低于對照組(P<0.05)，其他時間點與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，與博萊霉素組在2、4、8 w時比較均有顯著性差異(均P<0.05)。見表2。

2.3肺泡灌洗液中TNF-α表達量的變化 分別收集三組2、4 w肺泡灌洗液中的細胞(4 w后灌洗液細胞相對較少，提取RNA成功率低，故取消)，RT-PCR半定量分析TNF-α mRNA的表達量，結果顯示對照組細胞有微量TNF-α mRNA表達；博萊霉素組表達量明顯升高，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)；博萊霉素+DcR3組細胞有少量TNF-α mRNA表達，2 w時與對照組和博萊霉素組比較有顯著性差異(P<0.01)，4 w時與博萊霉素組比較仍有顯著性差異(P<0.01)，但與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。見圖1。肺泡灌洗液上清中TNF-α蛋白含量的檢查結果顯示：對照組各時間點TNF-α僅有微量表達；博萊霉素組該細胞因子的表達在各個時間點均高于對照組(P<0.01)，TNF-α的表達水平逐漸下降，至第8周與對照組和博萊霉素+DcR3組已無統計學差異(P>0.05)，博萊霉素+DcR3組二者的表達與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，與博萊霉素組比較有顯著性差異(P<0.05)。見表3。

表1 病理切片肺泡炎程度評分結果

表2 病理切片纖維化程度評分及BALF細胞計數

圖1 TNF-α RT-PCR電泳結果

2.4肺組織切片染色結果 正常對照組：光鏡觀察可見大鼠肺結構清晰，各觀察點均未出現明顯改變，Masson染色未見綠色膠原沉積。博萊霉素組：6 w時肺泡結構破壞明顯，肺泡壁增厚，成纖維細胞大量增多，肺間質纖維化瘢痕形成，毛細血管腔閉塞，Masson染色可見肺泡間隔內有大量綠色膠原沉積；8 w時改變基本同6 w，Masson染色可見大量綠色膠原沉積。博萊霉素+DcR3組：6 w時無炎性細胞浸潤，偶見綠色膠原沉積，較4 w無增多趨勢；8 w時改變基本同6 w，可見大部分正常肺泡結構。

2.5肺組織羥脯氨酸含量測定 對照組有微量羥脯氨酸表達，各時間點含量無明顯變化；博萊霉素組羥脯氨酸含量逐漸升高，6 w時達到高峰，各時間點與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；博萊霉素+DcR3組羥脯氨酸含量在4～8 w時與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，與博萊霉素組比較有顯著性差異(P<0.05)。見表4。

表3 BALF上清中TNF-α含量的檢測

表4 肺組織中羥脯氨酸含量的測定

3 討 論

DcR3又稱TR6，為1998年Pitti等〔3〕發現的一種可溶性TNF受體(TNFR)超家族成員，可與Fas、HVEM、DR3競爭結合其相應配體FasL、LIGHT及TL1A，抑制細胞凋亡，在細胞的生長、分化、死亡以及免疫調節等方面發揮重要作用，與多種疾病等密切相關。DcR3基因定位于人類第20號染色體長臂，20q13.3。DcR3 mRNA序列全長1 114 bp，含1個開放讀碼框，編碼300個氨基酸，N末端前29個氨基酸為信號肽序列，蛋白分子量約35 000 KD。DcR3肽鏈含4個串聯的富集半胱氨酸的重復序列，此為TNFR超家族的共同標志，但DcR3缺乏明顯的跨膜結構，屬于分泌性蛋白，可用于靜脈注射。目前關于DcR3的研究主要集中在腫瘤、自身免疫性疾病、胰島移植等方面〔4，5〕，在肺纖維化的研究中較少，本研究提示其可能有一定的抗炎作用〔6〕。同時Wortinger等〔7〕建立FasL誘導的急性肺損傷小鼠模型時發現，預先用DcR3類似物處理的小鼠較未經處理的小鼠中性粒細胞浸潤減少，支氣管肺灌洗液中的GM-CSF、MIP及KC等炎性介質顯著降低。文獻〔8〕也報道，局部注射可以改善風濕性關節炎的關節活動度，DcR3可以直接中和實驗性自身免疫性腦脊膜炎局部的炎癥和下調Th1T細胞的數目，抑制干擾素(IFN)-γ和白細胞介素(IL)-17或TNF-α表達。

大量的動物實驗和臨床實驗發現〔9〕，肺纖維形成早期局部肺組織存在大量炎性細胞浸潤，各種促炎性物質在肺組織局部聚集。參與的細胞因子和其他的介質較多，且在不同階段所參與的細胞因子有所不同，TNF-α、IL-1、的表達高峰在炎癥期，此后逐漸減弱；轉化生長因子(TGF-β)1、IL-10在早期表達，在炎癥期形成高峰，此后仍維持高水平表達，本研究說明DcR3的應用的確抑制了博萊霉素致肺纖維化大鼠模型的炎癥反應。

通常將肺纖維化的發生過程分為兩個階段，初始的肺泡炎階段即致病因素導致上皮損傷，上皮下基底膜破壞、炎癥細胞、免疫細胞活化，分泌各種炎癥因子；肺纖維化階段：在第一階段炎癥因子的作用下，成纖維細胞募集、分化、增生，膠原和細胞基質過度增生，肺纖維化形成。早期的炎癥因子TGF-β、TNF-α、IL-4、 IL-13以及 IFN-γ、IL-1β等的大量產生可激活體內一系列細胞信號傳導通路，如ERK-MAPK信號通路，其在啟動分子信號調節成纖維細胞增殖方面非常重要〔10，11〕。此外，JNK-、p38-以及Smad等信號轉導通路均具有促進肌成纖維細胞分化的作用，這些通路均在炎癥因子的刺激下活化從而促進肺纖維的發生〔12〕。 可見阻止炎癥反應的擴大化，抑制某些關鍵細胞因子的釋放理論上可以預防肺纖維化的發生。

本研究通過延長觀察時間發現，早期注射DcR3組的大鼠其肺纖維化程度明顯減輕，甚至局限化，大鼠一般生活狀態明顯恢復，這提示DcR3早期的抗炎作用可能在一定程度上預防了肺纖維化的發生，但DcR3在肺纖維的形成是否存在直接作用，尚需要進一步研究。

4 參考文獻

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3Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DA，etal.Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer〔J〕.Nature，1998;396(6712)：699-703.

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7Wortinger MA，Foley JW，Larocque P，etal.Fas ligand-induced murine pulmonary inflammation is reduced by a stable decoy receptor 3 analogue〔J〕.Immunology，2003;110(2)：225-33.

8Fukuda K，Miura Y，Maeda T，etal.Decoy receptor 3 regulates the expression of various genes in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts〔J〕.Int J Mol Med，2013;32(4)：910-6.

9Eickmeier O，Boom LV，Schreiner F，etal.Transforming growth factor β1 genotypes in relation to TGF β1，interleukin-8，and tumor necrosis factor alpha in Induced sputum and blood in Cystic fibrosis〔J〕.Mediators Inflamm,2013;20(13)：913135.

10Hayashi S，Nishiyama T，Miura Y，etal.DcR3 induces cell proliferation through MAPK signaling in chondrocytes of osteoarthritis〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2011;19(7)：903-10.

11Cheng CP，Sytwu HK，Chang DM.Decoy receptor 3 attenuates collagen-induced arthritis by modulating T cell activation and B cell expansion〔J〕.J Rheumatol.2011;38(12)：2522-35.

12Bei Y，Hua-Huy T，Duong-Quy S，etal.Long-term treatment with fasudil improves bleomycin-induced pulmonary fibrosis and pulmonary hypertension via inhibition of Smad2/3 phosphorylation〔J〕.Pulm Pharmacol Ther,2013;26(6):635-43.