依達拉奉對大鼠腦缺血后中腦微血管密度、神經生長因子、腦源性神經生長因子表達的影響

朱 江 高燕軍 竇志杰 米艷娟 孫艷軍 龍雅君 韓玉敏

(承德醫學院附屬醫院神經內科，河北 承德 067000)

神經生長因子(NGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)可以明顯促進缺血后神經元的存活和生長發育，改善神經元的病理狀態，促進受損神經元再生及分化成熟，在中樞神經系統損傷修復過程中具有重要的作用〔1〕。近年來研究發現，BDNF和NGF對于新生血管亦有誘導和促進形成的作用〔2〕。依達拉奉是一種新型腦保護劑，具有清除自由基和神經保護作用〔3〕,可抑制腦細胞的過氧化作用和延遲神經元死亡，并減輕腦缺血和腦缺血引起的腦水腫和組織損傷〔4〕。本研究從依達拉奉對大鼠缺血腦組織中NGF和BDNF表達的改變及其最終對微血管分布的影響的角度，對依達拉奉在腦缺血過程中起到的保護作用進行深入的探討。

1 材料與方法

1.1動物與分組 60只Wistar成年健康雄性大鼠，220～240 g，購于河北醫科大學實驗動物中心。隨機分為假手術組，治療組，缺血對照組。按時間點分為7、14 d兩個亞組，其中假手術組每個亞組6只，其余每個亞組12只。

1.2方法

1.2.1腦缺血模型制備 結扎雙側頸總動脈：10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350 mg/kg),仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露分離出雙側頸總動脈并結扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動脈：大鼠俯臥固定，于后正中線第1頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開肌層，暴露第1頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入右側橫突孔內凝閉椎動脈3～4 s，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養。

1.2.2實驗動物的干預方法 假手術組只暴露雙側頸總動脈及右側椎動脈，不做血管阻斷處理。治療組、缺血對照組均在阻斷雙側頸總動脈及右側椎動脈后立即開始治療。實驗組腹腔注射依達拉奉2次/d，時間間隔12 h，每次注射計量按3 mg/kg計算，到術后7、14 d兩個時間點分別處死，取中腦腦組織。缺血對照組腹腔注射生理鹽水2次/d，時間間隔12 h，注射劑量為0.5 ml/次。到術后7、14 d兩個時間點分別處死，取中腦腦組織。

1.2.3實驗標本制作 應用10%水合氯醛 (350 mg/kg)，腹腔注射。仰臥位固定于鼠板上，快速剪開腹腔和胸腔的前壁，清晰的暴露出心臟，用連有輸液管的預先處理為鈍圓的針頭插入左心室內，快速輸入溫生理鹽水(37℃)100 ml，同時用眼科剪剪破右心耳，此時血液由右心耳處流出，待大鼠四肢末端變白，換上4%多聚甲醛〔0.1 mol磷酸鹽緩沖液(PBS)配成pH 7.4〕灌流固定。灌流結束后取出腦組織，用冰生理鹽水沖洗，除去血液。石蠟包埋切片。

1.2.4觀察指標 ①微血管密度：每只大鼠取3張切片，采用Simple PCI-8圖像分析軟件分析腦組織微血管灰度。每張切片在光鏡下選5個視野，取平均灰度值進行統計學分析。該分析儀器的灰度級為0～256灰級，平均灰度表示陽性細胞的反應強度，平均灰級越高，說明反應強度越低。②神經營養因子：NGF、BDNF蛋白表達的測定用SP免疫組織化學染色法，所有切片染色均采用相同條件，每批染色均設陰性對照。陰性對照用PBS替代一抗孵育切片。結果判定：陽性細胞的胞漿、胞膜、軸突呈棕黃色著色。圖像分析：用Simple PCI-8圖像分析軟件對圖像進行統計學分析。每張切片在光鏡下選5個視野，取平均灰度值進行統計學分析。該分析儀器的灰度級為0～256灰級，平均灰度表示陽性細胞的反應強度，平均灰級越高，說明反應強度越低。

2 結 果

2.1各組腦組織中NGF、BDNF灰度值的變化 通過對7、14 d后實驗動物的觀察，治療組及缺血對照組中灰度值較假手術組顯著增加。但是，治療組NGF、BDNF灰度值增加的程度低于缺血對照組。其中，治療組各時段NGF、BDNF灰度值均低于缺血對照組。與假手術組比較有統計學差異(P<0.05)。見表1。

2.2各組腦組織中微血管灰度的變化 通過對7、14 d后實驗動物的觀察，治療組及缺血對照組的微血管灰度值較假手術組均增加。治療組數值增加的幅度低于缺血對照組。其中，治療組微血管灰度值在各時段均低于缺血對照組。與假手術組相比較二者均有統計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織中NGF、BONF蛋白陽性表達灰度值及微血管灰度值比較±s)

3 討 論

腦缺血后，腦神經元損傷的程度與BDNF和NGF的表達水平密切相關〔5,6〕。腦缺血后，BDNF、NGF均增加〔7〕，通過拮抗興奮性氨基酸毒性，穩定細胞內鈣離子濃度；增強抗氧化酶活性，減輕自由基損傷；抑制細胞凋亡，增強蛋白酶活性；修復受損神經元，促進神經元再生機制〔8〕提高神經元的抗損傷能力〔9〕。

在腦缺血后，出現神經元數量及微血管密度的減少，神經膠質細胞數量的增加。在缺血條件下，神經膠質細胞大量增生填充于壞死區域，引起局部微循環障礙，即微血管凋亡的數量大于其新生的數量。研究發現BDNF參與內皮細胞的調解，與血管新生有關。BDNF是神經營養因子，對神經細胞的生長發育、損傷修復有重要作用〔10〕。有研究證實，100 μg/L的BDNF體外促內皮細胞血管新生能力與25 μg/L血管內皮生長因子(VEGF)相當，為一種新的促血管新生因子〔11〕。在體外促進內皮細胞生長，在體內誘導血管的發生。

依達拉奉是目前臨床上廣泛使用的自由基清除劑，可通過血腦屏障，抑制脂質過氧化反應，減輕腦組織花生四烯酸引起的腦水腫，縮小缺血半暗帶的面積，抑制遲發性神經細胞的死亡，還可以防止血管內皮細胞損傷。依達拉奉清除自由基，提高BDNF、NGF水平，進一步影響血管新生數量。

本研究提示依達拉奉不僅具備清除自由基的作用，還可以通過激發NGF途徑對神經元起到保護作用。更重要的是，微血管密度增加可從根本上改善腦組織缺血造成的損傷。同時提示微血管密度增加可促進NGF、BDNF的表達，NGF又進一步刺激微血管新生，即二者之間是相互促進的正性刺激過程。

4 參考文獻

1董為偉.神經保護的基礎與臨床〔M〕.北京：科學出版社，2002: 239-45.

2胡 豫，孫春艷，王雅丹，等.腦源性神經營養因子(BDNF)在多發性骨髓瘤患者血漿中的表達增高及其意義的初步研究〔J〕. 中國實驗血液學雜志，2005;13(1)：104-9.

3Shimon A,Tatsushi K,Chikako N,etal.Anti-apoptotic and neuroprotective effects of edaravone following transient focal ischemia in rats〔J〕. Eur J Pharmacol,2005;516(2):125-30.

4楊 政，吳玉林.治療急性腦梗死的新型腦保護藥依達拉奉〔J〕.中國新藥雜志，2002;11(12)：911-3.

5Jia HP,Schutte BC,Schudy A,etal.Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach〔J〕.Gene,2001;263(1-2): 211-8.

6Gura T,Innate immunity.Ancient system gets new respect〔J〕. Science,2001;291(5511):2068-71.

7陳景紅，高俊淑，李 娜，等.老年急性腦梗死患者VEGF和GFAP水平的動態變化〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(4)：687-8.

8Lemaitre B,Reichhart JM,Hoffmann JA.Drosophila host defense:differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganism〔J〕. Proc Natl A cad Sci USA,1997;94(26):14614-9.

9方秀斌.神經肽與神經營養因子〔M〕. 北京：人民衛生出版社，2002:289-94.

10王雅丹，胡 豫，孫春艷. AKt、ERK1/2活化在腦源性神經營養因子促血管新生中的作用〔J〕. 中國病理生理雜志，2007;23(5)：833-8.