miR-20a對前列腺癌細胞的侵襲及其機制

張政偉 強曉菲 付建華 郭 利 王志勇

(承德醫學院，河北 承德 067000)

前列腺癌是中老年男性生殖系統最常見的惡性腫瘤，也是男性癌死亡的主要病因之一〔1〕。由于早期癥狀不明顯，診斷時患者歲數一般較大，并且容易發生轉移，導致預后不良。因此探討前列腺癌發生和轉移的分子機制為提高診斷和預后至關重要。微小RNA(microRNA或miRNA)是一類內源性的，非編碼單鏈RNA分子，在轉錄后水平調控基因的表達〔2,3〕。miRNA在多種生物學過程中發揮著作用〔4,5〕。研究表明miRNA的表達異常與腫瘤的發生、發展關系密切〔6〕，在腫瘤中扮演著腫瘤抑制基因或者癌基因的角色〔7〕。本研究檢測miR-20a在前列腺癌組織和細胞中的表達水平，探討miR-20a對前列腺癌細胞生長和侵襲的影響，并尋找miR-20a的靶基因來闡述其發揮作用的機制。

1 材料和方法

1.1材料和試劑 30對前列腺癌和正常組織來源于河北承德醫學院附屬醫院泌尿外科。樣本得到病人的同意并通過病理學和免疫組化方法加以驗證。miR-20a ASO和對照寡核苷酸以及含有ABL2 3'UTR的熒光報告載體均購自上海吉瑪生物技術公司，轉染試劑LipofectamineTM 2000購自Invitrogen公司，組織和細胞miRNA提取試劑盒購自Qiagen公司，反轉錄酶購自Fermentas公司，實時定量PCR的SYBR Green Mix購自Takara公司。體外細胞侵襲的Transwell小室購自Millipore公司。兔抗人ABL2抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體以及羊抗兔的二抗均購自武漢三鷹公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和轉染 本實驗涉及的所有細胞均用含有10%血清的培養液在5%CO2、37℃孵箱中培養。正常前列腺上皮細胞(RWPE-1)的培養基是角細胞無血清培養液(K-SFM)，并含有0.05 mg/ml BPE和5 ng/ml 表皮生長因子(EGF) 。前列腺癌細胞DU145、PC-3和LNCaP的培養基是RPMI 1640，而VCaP的培養基是DMEM。細胞在轉染前接種到6孔板或者48孔板，待第2天細胞密度達到80%時利用LipofectamineTM 2000進行轉染。

1.2.2RNA提取和實時定量PCR 組織和細胞中miRNA的提取根據miRNA提取試劑盒的說明進行。提取的RNA利用NanoDrop ND-1000進行濃度和質量的測定。取500 ng RNA進行反轉錄反應，對于miRNA的反轉錄反應，利用miR-20a的特異性反轉錄引物。得到的cDNA產物稀釋5倍后取2 μl進行PCR反應，反應體系是：cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，2×SYBR Green Mix 10 μl，無菌蒸餾水6 μl。在ABI 7 300實時定量PCR儀上進行。反應條件是：95℃ 30 s，隨后進行95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s 40個循環。本實驗以U6 RNA作為內參檢測組織和細胞中miR-20a的表達水平。

1.2.3細胞克隆形成實驗 將轉染后的前列腺癌細胞以200個細胞/孔的密度接種到12孔板，細胞培養液每隔3 d換1次，大概10 d，大部分細胞克隆含有超過50個細胞時，倒掉培養液用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞后，利用5%結晶紫進行克隆染色，染色后在顯微鏡下拍照并進行計數。

1.2.4體外細胞侵襲實驗 將轉染的細胞消化后重懸在無血清培基中，接種到含有Matrigel的Transwell小室內(2.5×104細胞)，小室外是含有10%血清的培養基。待細胞侵襲20 h，取出小室，用PBS清洗、4%甲醛固定、甲醇穿透后，將未穿過小室膜的細胞用棉簽擦去，穿過膜的細胞用5%結晶紫染色，最后在顯微鏡下拍照，隨機選擇細胞分布相對均勻的視野，計數平均每個視野下穿透的細胞數。

1.2.5Western 印跡實驗 細胞轉染48 h后，PBS清洗細胞，利用RIPA裂解液提取細胞的蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質的濃度。取15 μg蛋白進行十二烷基本硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，之后轉膜、封閉，用兔抗人的ABL2抗體室溫孵育2 h，Tis鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，二抗用帶有辣根過氧化物酶的羊抗兔抗體室溫孵育1 h后增強化學發光法(ECL)顯影，并分析條帶的強度。本實驗利用GAPDH作為內參檢測ABL2的表達水平。

1.2.6生物信息學預測 本實驗中，靶基因預測遵循以下原則：(1)靶基因預測軟件TargetScan、miRanda和microRNA.org預測的靶基因3'UTR含有miR-20a的結合位點；(2)候選靶基因的功能與miR-20a的作用相關；(3)靶基因在前列腺癌中是表達的。

1.2.7綠色熒光蛋白(GFP)熒光報告載體實驗 細胞同時轉染miR-20a的ASO和含有ABL2 3'UTR的報告載體以及ASO的對照和ABL2 3'UTR的報告載體。轉染48 h后，PBS清洗細胞，利用RIPA裂解液提取細胞的蛋白。利用熒光測定儀器測定GFP的熒光強度。本實驗中，細胞轉染的同時轉染表達紅色熒光紅色熒光蛋白(RFP)的質粒作為內參。

2 結 果

2.1實時熒光定量PCR檢測前列腺癌組織和細胞中miR-20a的表達 與正常組織相比，24例前列腺癌中miR-20a的表達水平升高。利用實時定量PCR檢測正常前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺癌細胞中miR-20a的水平，結果顯示miR-20a在前列腺癌細胞中表達明顯升高(RWPE-1、LNCaP、PC-3、DU145、VCaP細胞miR-20a mRNA表達量分別為1.0、2.41、5.83、7.92、3.16，均P<0.05)。

2.2miR-20a對前列腺癌細胞增殖和侵襲的影響 ASO組細胞內miR-20a的表達水平較對照組降低約80%(PC細胞：0.14 vs 1.0；DU 125細胞：0.21 vs 1.0)(P<0.05)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，轉染miR-20a ASO組的PC-3(86.48 vs 97.26)和DU145細胞(79.57 vs 88.93)克隆形成數較對照組降低約15%。Transwell小室實驗，miR-20a ASO組細胞穿過膜的細胞數明顯低于對照組(PC細胞：25.31 vs 60.24,DU145細胞：47.72 vs 112.38)減少約60%(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-20a對前列腺癌細胞增殖和侵襲的影響

2.3miR-20a靶定ABL2靶基因 遵循靶基因篩選原則，初步選擇ABL2作為miR-20a的候選靶基因，ABL2 3'UTR與miR-20a的結合位點。在細胞中同時轉染miR-20a ASO和ABL2 3'UTR，GFP熒光報告載體實驗顯示，miR-20a ASO組中ABL2 3'UTR的熒光強度(PC-3細胞：1.32， DU125細胞：1.41)較對照組(1.0)增強(P<0.05)。但是，將結合位點內部分堿基進行突變后，miR-20a ASO對突變的ABL2 3'UTR沒有影響(GFP熒光強度：PC-3細胞1.08，DU125細胞0.94，對照組為1.0)，說明ABL2是miR-20a的直接靶基因。而且,Western 印跡結果顯示，miR-20a ASO組細胞中ABL2的蛋白水平(PC-3、DU145、LNCaP、VCaP細胞分別為3.41、2.13、2.82、1.92)較對照組(1.0)升高，而過表達miR-20a的mimics組細胞中ABL2的表達水平(PC-3、DU145、LNCaP、VCaP細胞分別為0.21、0.32、0.47、0.58)降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-20a靶基因ABL2驗證

2.4干擾ABL2表達對前列腺癌細胞侵襲的影響 轉染siRNA的細胞中ABL2的水平降低約80%(對照組為1.0，PC-3細胞：0.18，DU145細胞：0.21)(P<0.05)。體外侵襲實驗結果顯示，與siRNA對照組相比，ABL2 siRNA組的細胞穿過膜的細胞數升高約1.5或者2倍(PC-3細胞：siRNA對照組vs ABL2 siRNA組為61.12 vs 143.67;DU145細胞：siRNA對照組vs ABL2 siRNA組為43.23 vs 106.75)，且差異均具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 RNA干擾ABL2表達對前列腺癌細胞侵襲的影響

2.5補救實驗驗證miR-20a通過靶定ABL2調控前列腺癌細胞的侵襲 ABL2 siRNA可以恢復由miR-20a ASO引起的ABL2水平的升高(圖4A，4B)；體外侵襲實驗結果同樣顯示，ABL2 siRNA組中細胞穿膜數較對照組升高，說明ABL2 siRNA可以恢復由miR-20a ASO引起的細胞侵襲能力的降低(P<0.05)(見圖4C)。

圖4 補救實驗驗證miR-20a通過靶定ABL2調控前列腺癌細胞的侵襲

3 討 論

miRNA作為基因表達中一類重要的調控因子，與腫瘤的發生發展關系密切。在本研究結果與其他研究中的發現一致，例如，miR-20a可以促進膽囊癌細胞的侵襲和轉移〔8〕；miR-20a通過調控Fas基因的表達從而增加骨肉瘤細胞發生轉移的能力〔9〕。miR-20a位于13號染色體，是miR-17-92基因簇的成員。該基因簇編碼6個miRNA，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、 miR-20a、miR-19b和miR-92a〔10〕。該家族成員在大部分腫瘤中表達較高，發揮著癌基因的作用。

本研究中，生物信息學方法預測顯示ABL2是miR-20a的潛在靶基因。GFP熒光報告載體實驗顯示，轉染miR-20a ASO的細胞中miR-20a的表達降低后，ABL2 3'UTR的熒光強度增強，而將結合位點部分堿基突變后導致作用消失，同時Western 印跡實驗也證實抑制miR-20a表達后，ABL2的蛋白水平降低，證實ABL2是miR-20a的直接靶基因。miR-20a通過作用于ABL2 3'UTR上的結合位點而抑制ABL2的表達水平。

ABL2，即非受體的酪氨酸激酶 Abelson相關基因，位于1號染色體，通過調控細胞骨架參與對細胞形態以及侵襲遷移能力的調控〔11〕。RAS的作用因子RIN1可以通過與ABL蛋白的SH2和SH3結構域結合，從而激活ABL2的催化活性，引起下游細胞骨架調控因子的磷酸化，在細胞黏附、侵襲和遷移過程中發揮著重要的作用〔12〕。這些研究表明ABL2參與對細胞侵襲行為的調控。本研究也得到了類似的結果，ABL2的表達敲降后，細胞的侵襲能力增強，并且可以恢復由miR-20a封閉所引起的細胞侵襲能力的降低，進一步驗證ABL2介導miR-20a對細胞侵襲行為的發揮。

綜上，miR-20a通過抑制ABL2的表而促進前列腺癌細胞的侵襲，發揮著癌基因的作用。因此，抑制miR-20a的表達有可能為以后前列腺癌的分子治療奠定理論基礎。雖然基因治療在臨床應用上還有很大的障礙，但是癌癥發生過程關鍵分子的發現可以提供更多的依據和策略。

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