Twist基因沉默促進人胃癌SGC7901細胞凋亡的機制

劉洪義 于金海 王大廣 所 劍

(天津市南開醫(yī)院，天津 300100)

Twist異常高表達可能引起腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤、橫紋肌肉瘤、前列腺癌等惡性腫瘤中Twist呈高表達〔1～3〕。多數(shù)學者認為Twist是癌基因，能調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用〔4〕。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，Twist在正常胃組織中低表達，而在胃癌組織中高表達，表明Twist可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。通過對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-Twist質(zhì)粒的人胃癌SGC7901細胞的生長活力的研究發(fā)現(xiàn)，Twist基因沉默可抑制SGC7901細胞的增殖〔5〕，探討細胞生長抑制的機制時發(fā)現(xiàn)，Twist基因沉默可促進SGC7901細胞凋亡〔6〕。本研究將進一步探討Twist基因沉默促進SGC7901細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1材料 人SGC7901細胞株由吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院中心實驗室惠贈；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-Twist質(zhì)粒的SGC7901細胞株由本實驗室建立；RPMI1640和H-DMEM培養(yǎng)液購于Invitrogen公司；小牛血清購自杭州四季青公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基；p53單克隆抗體、Bax-FITC單克隆抗體、Bcl-2-FITC單克隆抗體、羊抗鼠IgG-FITC購自Santa Cruz公司；Caspase3、9檢測試劑盒和Fluo3AM試劑盒購自碧云天生物試劑公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人SGC7901細胞株和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-Twist質(zhì)粒SGC7901細胞株培養(yǎng)于含10%小牛血清RPMI1640的培養(yǎng)液中，在5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

1.2.2細胞分組 根據(jù)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不同分為對照組，空載體組，Twist基因沉默組。

1.2.3AnnexinV-FITC/PI染色觀察沉默Twist基因?qū)毎挠绊?每組細胞培養(yǎng)至90%融合，收集1×106細胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用1 ml細胞染色緩沖液重懸細胞，各組分別加入5 μl AnnexinV-FITC染液和10 μl PI染液，輕輕混勻，4℃避光30 min后將細胞滴在載玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察，剩余細胞懸液流式細胞儀檢測。

1.2.4Twist基因沉默后對SGC7901細胞p53、Bcl-2 和Bax蛋白表達的影響 p53蛋白的檢測：每組細胞培養(yǎng)至90%融合，胰酶消化，離心收集1×106個細胞，75%冷乙醇固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，正常山羊血清50 μl 4℃封閉30 min，阻止非特異結(jié)合，各組加入鼠源p53單克隆抗體1 μl，4℃避光反應45 min，PBS洗2次，各組加入羊抗鼠IgG-FITC 1 μl，總體系50 μl，4℃反應45 min，PBS洗2次，用300 μl PBS重懸細胞后，流式細胞儀檢測。

Bcl-2和Bax蛋白的檢測：每組細胞培養(yǎng)至90%融合，胰酶消化，離心收集1×106個細胞，75%冷乙醇固定，PBS洗2次，分組加入Bcl-2-FITC抗體20 μl，Bax-FITC抗體10 μl，總體系50 μl，4℃避光反應45 min，PBS洗2次，用300 μl PBS重懸細胞后，流式細胞儀檢測。

1.2.5Twist 基因沉默后對SGC7901細胞Caspase3、9 活性檢測 實驗方法參照試劑盒說明書。

1.2.6Twist基因沉默對SGCC7901細胞Ca2+含量的影響 每組細胞培養(yǎng)至90%融合，胰酶消化，離心收集1×106個細胞，PBS洗3次，加入終濃度為10 μmol/L的Fluo-3 AM于37℃，5%CO2孵箱內(nèi)負載50 min，PBS洗3次，再次孵育30 min后于流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm 條件下檢測熒光強度。

2 結(jié) 果

2.1AnnexinV/PI染色觀察Twist基因沉默對SGC7901細胞的影響 激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示，與對照組和空載組相比，Twist基因沉默組中有較多的細胞呈現(xiàn)綠色熒光，未見明顯的呈現(xiàn)紅色熒光的細胞。進一步采用流式細胞儀檢測，Twist基因沉默組AnnexinV-FITC陽性細胞的比例〔(37.74±2.997)%〕明顯高于SGC7901組〔(14.92±2.163)%〕和空載體組〔(15.32±1.901)%〕(P<0.01)。見圖1。

對照組 空載體組 Twist基因沉默組

2.2Twist基因沉默后對SGC7901細胞p53、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 Twist基因沉默組p53蛋白表達量(69.21±3.275)顯著高于對照組(33.36±28.67)和空載體組(28.57±2.342)(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達量(19.56±1.154)顯著低于對照組(75.35±2.132)和空載體組(108.51±3.294)(P<0.01)，Bax蛋白表達比例(52.63±2.695)顯著高于對照組(26.13±1.267)和空載體組(46.37±2.953)(P<0.01)。

2.3Twist 基因沉默對SGC7901細胞Caspase3、9活性及Ca2+含量的影響 Twist 基因沉默組Caspase3、9活性明顯高于對照組和空載體組(P<0.01，P<0.05)。Ca2+含量顯著高于對照組和空載體組(P<0.05)。見表1。

表1 Twist基因沉默對SGC7901細胞Caspase3、9活性及Ca2+含量的影響±s)

3 討 論

細胞凋亡是機體細胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的程序性死亡過程。Twist蛋白在細胞程序性死亡過程中發(fā)揮了調(diào)控作用。SCS中的Twist-1單倍劑量不足能夠誘導顱蓋成骨細胞凋亡，哺乳動物Twist-1純合性失活模型出現(xiàn)大量凋亡〔7〕。Twist-2對細胞因子誘導的凋亡極其敏感〔8〕。小鼠胚胎成纖維細胞體外實驗進一步表明，Twist-1能夠干ARFp53調(diào)節(jié)途徑，阻斷c-myc誘導的凋亡反應〔9〕，而且在鼠間充質(zhì)細胞C3H10T1/2中DNazyme介導的小鼠Twist-1轉(zhuǎn)錄因子斷裂促進了細胞凋亡〔10〕。Rosivatz等〔11〕在研究原發(fā)性胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程中發(fā)現(xiàn)Twist在此過程中發(fā)揮重要作用。提示Twist的表達影響胃癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。Stasinopoulos等〔12〕的研究結(jié)果表明，Twist能通過抑制細胞分化、干預p53腫瘤抑制基因通路、誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變等在腫瘤的侵襲和進展中發(fā)揮重要作用。本研究前期工作證實Twist基因沉默促進SGC7901細胞凋亡〔6〕，本研究證實Twist基因沉默促進細胞早期凋亡的發(fā)生。目前研究表明Twist是一種癌相關(guān)蛋白，能通過抑制ARF-p53依賴和非依賴途徑調(diào)節(jié)凋亡，可能作用于p53調(diào)節(jié)的不同步驟，包括轉(zhuǎn)錄控制和翻譯后修飾〔13〕。本研究證實Twist基因沉默可促進細胞p53蛋白的表達。p53通過Bax/Bcl2，F(xiàn)as/Apo1，IGF-BP3等蛋白，可完成對細胞凋亡的調(diào)控作用。p53可以上調(diào)Bax的表達水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達共同完成促進細胞凋亡作用〔14〕。Twist基因沉默后SGC7901細胞發(fā)生凋亡與線粒體跨膜電位關(guān)系密切〔6〕。提示Twist沉默的SGC7901細胞發(fā)生凋亡有可能主要受線粒體介導的細胞凋亡途徑調(diào)控。Bcl-2蛋白主要是通過對抗線粒體破裂的離子失衡，從而阻斷細胞色素C釋放，或直接抑制Caspase活化從而抑制細胞凋亡反應的。此外，促凋亡蛋白Bax可使線粒體膜通透性增強激活Caspase-3和Caspase9，最終實現(xiàn)線粒體介導的細胞凋亡途徑。研究表明，胃癌的發(fā)生可能源于前凋亡蛋白Bax的失活。本研究顯示沉默Twist基因后可顯著升高細胞中Bax的表達，同時降低Bcl-2的表達。提示Bcl-2家族蛋白在Twist基因沉默后誘導的胃癌細胞凋亡的途徑中發(fā)揮了關(guān)鍵作用；同時Twist沉默組細胞中Caspase3、9活性明顯高于對照組，提示Twist沉默后可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達，激活Caspase3、9，實現(xiàn)線粒體介導的細胞凋亡途徑。另一方面，在透射電鏡下還發(fā)現(xiàn)沉默組細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴張〔6〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、翻譯后修飾、折疊和維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的主要場所，同時也是鈣儲備和鈣信號轉(zhuǎn)導的主要部位。本研究提示沉默 Twist基因后可能使細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞內(nèi)鈣儲存量增加。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+穩(wěn)態(tài)的的失衡可以直接導致細胞發(fā)生凋亡。Ashkenazy-Shahar〔15〕等研究發(fā)現(xiàn)通過抑制鈣外流和Ca2+直接進入細胞均能使細胞發(fā)生凋亡、損傷或壞死。

4 參考文獻

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