養(yǎng)血清腦顆粒改善血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元氧化損傷的機制

王宏英 劉 磊 譚 巖 方艷秋

(長春中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學教研室，吉林 長春 130117)

血管性癡呆(VD)是危害老年人身心健康的常見病、多發(fā)病〔1〕。VD多源于缺血性腦病，出血性腦病及急慢性缺血缺氧性腦病所致的智能及認知功能障礙臨床綜合征，主要的病理學改變包括皮質(zhì)萎縮、皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元變性、白質(zhì)疏松、膠質(zhì)細胞增生和毛細血管床改變等。氧化應(yīng)激損傷是加重缺血后腦損傷的重要機制之一〔2〕。本研究擬明確腦缺血后海馬自由基的變化規(guī)律和對神經(jīng)元細胞凋亡的作用，探索養(yǎng)血清腦顆粒對腦組織自由基的清除作用和對大鼠認知功能維持的影響。

1 材料與方法

1.1VD大鼠模型制備 健康雌性Wistar大鼠36只，鼠齡4～7個月，體重280～350 g，吉林大學實驗動物中心提供和喂養(yǎng)。隨機分為假手術(shù)組(正常對照組)、模型對照組、養(yǎng)血清腦顆粒組。大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的遠近端，并從中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈血流。假手術(shù)組除不結(jié)扎、不剪斷雙側(cè)頸總動脈外，其余過程與手術(shù)組相同。養(yǎng)血清腦顆粒組術(shù)前10 d及術(shù)后每天用養(yǎng)血清腦顆粒灌胃，共灌胃45 d。假手術(shù)對照, 模型對照組大鼠給予生理鹽水3 ml/d,1次/d灌胃。

1.2實驗試劑及儀器 養(yǎng)血清腦顆粒浸膏(簡稱養(yǎng)血清腦顆粒，批準文號：國藥準字Z10960082)，由天士力制藥集團提供，每克浸膏含生藥7 g，以蒸餾水將浸膏稀釋4.8 g/ml，每只大鼠給藥容積為10 ml/kg。超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)和乙酰膽堿酯酶(AchE)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。細胞凋亡檢測試劑盒購自貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司。

1.3記憶功能的測定 于造模后第15天采用Morris水迷宮法進行大鼠記憶功能的測定。實驗訓(xùn)練階段連續(xù)進行4 d，每天訓(xùn)練2次，進行Morris水迷宮的定位航行實驗訓(xùn)練。之后連續(xù)4 d進行定位巡航實驗，每日2次,計算平均成績。

1.4海馬組織SOD、MDA、AchE的檢測〔3〕海馬組織稱重后，加入9倍冰生理鹽水，電動勻漿機中研磨成10%勻漿，3 500 r/min，離心10 min。取上清液，G250法測定總蛋白含量，以供生化指標檢測。用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA水平。AchE能使乙酰膽堿(Ach)水解成膽堿和乙酸,膽堿可以與巰基顯色劑反應(yīng)生成黃色化合物對硝基三苯(TNB)，根據(jù)顏色深淺進行比色定量，水解產(chǎn)物膽堿的數(shù)量可反映AchE的活力。

1.5海馬神經(jīng)元細胞凋亡率的測定〔4〕取腦組織0.5～1 g，放入清潔干燥的燒杯內(nèi)，加適量PBS液，用銳利眼科剪刀將組織剪碎，300目尼龍網(wǎng)過濾至離心管內(nèi)，1 500 r/min，5 min，棄上清后加入PBS液5 ml混勻離心洗滌2次，棄上清調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml。乙醇固定于4℃冰箱保存。檢測前PBS液洗滌2次去上清液，加入PI染液500 μl/管, 避光靜置30 min后用流式細胞儀進行細胞倍體及周期檢測。

2 結(jié) 果

2.1大鼠認知功能比較 模型對照組大鼠逃避潛伏期及逃避路徑長度較假手術(shù)組大鼠明顯延長(P<0.05)，而養(yǎng)血清腦顆粒組大鼠逃避潛伏期及逃避路徑長度比模型對照組大鼠明顯縮短(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期逃避路徑比較(n=6,±s)

2.2海馬組織SOD、MDA、AchE水平比較 與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠腦組織SOD水平顯著降低，MDA水平顯著增高(P<0.05)。養(yǎng)血清腦顆粒組大鼠海馬SOD水平增高，并降低了MDA的表達，與模型對照組相比差異顯著(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型對照組大鼠海馬中AchE活性明顯上升(P<0.05)；與模型對照組相比，養(yǎng)血清腦顆粒組能明顯降低大鼠海馬組織中AchE活性(P<0.05)。見表2。

表2 不同組大鼠腦組織內(nèi)SOD活性、MDA含量、AchE活性測試結(jié)果±s,n=6)

2.3流式細胞儀測定凋亡細胞百分率 與假手術(shù)組〔(6.45±2.42)%〕比較，模型對照組細胞凋亡百分率〔(19.21±4.52)%〕明顯提高(P<0.05)。與模型對照組比較，養(yǎng)血清腦顆粒組能明顯降低大鼠腦組織細胞凋亡百分率〔(11.12±3.05)%〕(P<0.05)。

3 討 論

VD是常見的老年期癡呆，常表現(xiàn)為波動性病程或階梯式惡化，療效及預(yù)后較好，尤其是在VD早期病情不嚴重時，故早期診斷和治療具有很大意義〔5〕。

本研究中模型對照組大鼠的學習記憶能力下降，與VD臨床表現(xiàn)智能水平下降、記憶力減退一致。海馬是參與空間學習記憶的重要結(jié)構(gòu)，慢性腦缺血時的腦部低灌注引起的海馬神經(jīng)元損傷，被認為是VD進程中學習記憶能力障礙的病理基礎(chǔ)〔6〕。

Ach是學習記憶功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，腦內(nèi)Ach水平下降可導(dǎo)致學習記憶能力下降〔7〕。AchE是Ach的水解酶，是檢測Ach活性的標志。研究表明〔8〕，海馬神經(jīng)元功能受到損害時，AchE的活性升高；當神經(jīng)元功能恢復(fù)時，AchE的活性也隨之降低。本實驗提示養(yǎng)血清腦顆粒可以通過改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能而改善VD大鼠學習記憶障礙。

由于腦對氧的利用高，同時又含有大量的易被氧化的不飽和脂肪酸，因此腦細胞很容易受到自由基的攻擊。自由基具有破壞神經(jīng)細胞膜脂質(zhì)代謝、結(jié)構(gòu)和導(dǎo)致酶失活的作用。自由基及脂質(zhì)過氧化在缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用〔9〕。SOD能清除超氧陰離子自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，保護細胞免受損傷，SOD活力的高低間接反映機體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的終末產(chǎn)物，其含量可反映脂質(zhì)過氧化水平，MDA的高低又間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本研究證實，模型組大鼠腦組織SOD活力降低MDA含量增高。受損腦細胞不能及時清除自由基，細胞損傷更為嚴重，導(dǎo)致正常的功能缺失，進而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)癥狀，腦部的神經(jīng)元變性壞死。養(yǎng)血清腦顆粒能夠改善VD 動物模型中腦組織的自由基水平，降低自由基對腦組織的進一步損傷，改善大鼠的認知能力。

研究認為，細胞凋亡在缺血性腦損傷的病理過程中起著關(guān)鍵性作用〔10〕。我們應(yīng)用流式細胞術(shù)對大鼠腦組織進行細胞凋亡特異性檢測發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠細胞凋亡比例顯著多于假手術(shù)組，說明自由基對神經(jīng)元造成嚴重損傷誘導(dǎo)了凋亡的發(fā)生，這一實驗結(jié)果與以往文獻報道基本一致。自由氧物質(zhì)通過抑制線粒體電子傳遞鏈中的酶復(fù)合物導(dǎo)致線粒體功能障礙被認為是VD大鼠神經(jīng)細胞凋亡的重要啟動因素〔11〕。與模型組比較，養(yǎng)血清腦顆粒組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡比例明顯降低，說明養(yǎng)血清腦顆粒具有抑制細胞凋亡的作用，這種作用可能與養(yǎng)血清腦顆粒對腦組織內(nèi)氧自由物質(zhì)的清除密切相關(guān)。

基礎(chǔ)研究證實，養(yǎng)血清腦顆粒可以從炎癥相關(guān)基因、血管擴張相關(guān)基因、免疫相關(guān)基因等多方面影響腦基因表達譜。本研究揭示養(yǎng)血清腦顆粒降低VD大鼠海馬區(qū)自由基水平，減輕神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，改善大鼠認知功能，可能是防治慢性腦缺血所致VD 的認知功能障礙的有效手段。

4 參考文獻

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11Bennett SA, Tenniswood M, Chen JH,etal. Chronic cerebral hypoperfusion elicits neuronal apoptosis and behavioral impairment〔J〕 .Neuroreport, 1998；9(1):161-6.