依達拉奉對糖尿病大鼠腦缺血再灌注海馬區(qū)神經元凋亡的影響

丁 欣 陳曉敏 吳迪賓 趙 雷 陳德杰 鄧遠飛 萬匯涓 黃春嬌

(北京大學深圳醫(yī)院特診/老年病科，廣東 深圳 518036)

細胞凋亡調控因子Fas介導的細胞凋亡是糖尿病腦缺血再灌注海馬神經元損傷機制之一〔1〕，由此推測阻斷Fas在糖尿病腦缺血再灌注后的表達，就會減少神經元的凋亡。目前有關依達拉奉對糖尿病腦缺血再灌注海馬神經細胞凋亡調控基因的研究尚少。本研究通過依達拉奉對糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷海馬區(qū)神經元凋亡及凋亡因子Fas蛋白的表達的研究，進一步探討依達拉奉對腦均保護作用。

1 材料和方法

1.1主要試驗器械及藥物 鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma)；SD大鼠(購自廣東動物實驗中心)；依達拉奉(必存注射液，南京先聲藥業(yè)有限公司)；Fas、TUNEL試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠21只，2～3月齡，體重150～180 g，高脂飲食1個月。動物隨機分為3組： MCAO組、MCAO+生理鹽水組、依達拉奉干預組。每組7只。

1.3糖尿病動物模型 各組動物按照魏文石等〔2〕報道的方法建立糖尿病動物模型。具體方法是：高脂飲食1個月的大鼠禁食8 h后，左下腹腹腔注射STZ 55～60 mg/kg體重，穩(wěn)定3 d后，用穩(wěn)豪血糖儀LifeScan OneTouchUItra (美國強生公司)測定大鼠尾尖血糖，隨機血糖16.7 mmol/L以上的大鼠判定為糖尿病大鼠。每3天測試血糖確證，常規(guī)飼養(yǎng)30 d，期間不進行胰島素干預，也不進行糖尿病飲食控制，動態(tài)觀察大鼠的癥狀和體征。

1.4腦缺血再灌注模型 局灶性腦缺血再灌注動物模型的建立按照文獻〔3，4〕報道的方法加以改進。大鼠腹腔內注射10%水合氯醛麻醉后，仰臥固定。頸部正中切口分離并暴露左側頸總動脈及頸外動脈，并在勁外動脈分叉處剪一小口，將長5 cm的尼龍線(直徑0.188 mm)順勢緩慢送入，深度為1.8 cm，在大腦中動脈起端填塞大腦中動脈血流。栓塞成功的大鼠在缺血后2 h拔線至頸外動脈殘端內進行再灌注，并結扎殘端。實行再灌注時輕抽提線頭即可。進行神經功能評分，選擇蘇醒后行走向右旋轉或右側肢體癱瘓(1～3分)的大鼠為栓堵成功者進行實驗。假手術組步驟同前，但不阻斷左側大腦中動脈。術后動物放在37℃的恒溫臺上直到蘇醒。

1.5依達拉奉干預 栓塞后30 min開始尾部靜脈注射依達拉奉(0.5 g/kg)，以后每12 h給藥1次，直到第3天動物處死為止。MCAO+生理鹽水組同樣時間給予等量生理鹽水； MCAO組不注射，只是在規(guī)定的時間點處死動物，斷頭取腦。

1.6病理標本制備 各組大鼠在腦缺血再灌注后3 d斷頭取出腦組織。具體方法是各組動物經10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉下左心室插管，依次灌入0.9%氯化鈉和4%多聚甲醛各100 ml后斷頭取腦。沿腦冠狀位額極后7～10 mm，將大鼠腦切成5 mm厚度的組織塊，組織塊經4℃4%多聚甲醛-0.01 MPBS液固定，剃度酒精脫水，低溫石蠟包埋。取有大體病變的組織塊從額側開始切取組織切片，切成厚度為6 μm。每個組織片每隔200 μm連續(xù)取6張，常規(guī)HE染色。

1.7TUNEL 法細胞凋亡檢測 嚴格按凋亡試劑盒所示步驟進行：腦組織石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫處理10 min，蒸餾水洗滌2 min連續(xù)3次，加ProteinaseK 37℃消化10 min，TBS洗2 min連續(xù)3次，加標記液37℃標記2 h，加封閉液室溫封閉30 min，加生物化抗地高辛抗體，37℃反應30 min，加SABC 37℃反應30 min，TBS沖洗5 min連續(xù)4次，DAB顯色；充分沖洗，蘇木素輕度復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片固定。光學顯微鏡下細胞核中有棕黃色顆粒者為TUNEL染色陽性的凋亡細胞，每只大鼠隨機取3張切片，在400倍物鏡下選取周圍5個不重復的視野，以目鏡網(wǎng)絡測試系統(tǒng)手工計數(shù)100 μm長度內的海馬CA1區(qū)TUNEL免疫組化陽性細胞數(shù)，取其平均值為最后結果。

1.8免疫組化法 Fas 檢測 腦組織石蠟切片脫蠟至水，染色方法參照試劑盒說明：3%H2O2消除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗3次；枸櫞酸鈉緩沖液熱修復抗原，小牛血清室溫下封閉15 min；滴加兔抗鼠Fas抗體，4℃過夜，陰性對照用0.01 mol/L PBS代替一抗；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20 min，PBS沖洗5 min連續(xù)4次；滴加試劑SABC，37℃水浴20 min，PBS沖洗5 min連續(xù)4次；DAB顯色，充分沖洗，不復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片固定，顯微鏡觀察。光鏡下細胞質著棕色為Fas表達陽性細胞。同樣每只大鼠隨機取3張切片，在400倍物鏡下選取周圍5個不重復的視野，以目鏡網(wǎng)絡測試系統(tǒng)手工計數(shù)100 μm長度內的海馬CA1區(qū)Fas免疫組化陽性細胞數(shù)，取其平均值為最后結果。

2 結 果

TUNEL法顯示：MCAO組海馬CA1區(qū)可見多量凋亡細胞(56.3±4.3)， 同樣MCAO+生理鹽水組海馬區(qū)均也可見多量的凋亡細胞(58.9±4.9)，比較無明顯差異(P>0.05)，而與兩組比較，依達拉奉干預組凋亡細胞數(shù)顯著減少(34.3±5.2)(P<0.05)。見圖1。免疫組化顯示：同樣MCAO組、MCAO+生理鹽水組大鼠海馬區(qū)均可見多量Fas陽性細胞，并且兩組比較無明顯差異(191.2±4.9 vs 189.2±4.2,P>0.05)，而依達拉奉干預組(158.5±3.5)與MCAO組、MCAO+生理鹽水組相比Fas陽性細胞明顯減少(P<0.01)，見圖2。

MCAO組

MCAO +生理鹽水組

依達拉奉干預組

MCAO組

MCAO+生理鹽水組

依達拉奉干預組

3 討 論

糖尿病不僅是缺血性腦血管病的獨立危險因素，而且可加重腦缺血再灌注后的損傷。本研究證明Fas介導的細胞凋亡機制是糖尿病加重腦缺血再灌注海馬神經元損傷機制之一〔1〕，由此推測阻斷Fas蛋白在糖尿病腦缺血再灌注后的表達，就會減少神經元的凋亡。

依達拉奉通過清除腦缺血后再灌注時大量產生的自由基及抑制脂質過氧化，減少神經細胞的凋亡，以及由腦缺血引起的腦水腫及神經細胞損傷，從而起到腦保護作用〔5～9〕。

本研究結果顯示TUNEI檢測糖尿病大鼠腦缺血再灌注海馬區(qū)神經元的凋亡情況，顯微鏡觀察顯示，EDA治療組凋亡的神經細胞數(shù)量均少于MCAO、MCAO+生理鹽水組。Fas蛋白免疫組化分析，依達拉奉治療組Fas陽性細胞數(shù)明顯少于MCAO、MCAO+生理鹽水組，P<0.01，與TUNEI檢測的結果一致，說明依達拉奉在糖尿病腦缺血再灌注損傷的過程中，可能通過抑制細胞凋亡因子Fas蛋白的表達起到保護神經的作用。

綜上所述，本研究顯示依達拉奉可通過抑制細胞凋亡因子、減少細胞凋亡從而減輕糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷。提示糖尿病腦缺血急性期應用依達拉奉可減少凋亡因子的表達從而起到保護海馬區(qū)神經的作用。但依達拉奉具體通過什么途徑、對其他細胞凋亡因子的影響尚需進一步研究。

4 參考文獻

1丁 欣，張季聲，吳 軍， 等. Fas蛋白在糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)的表達及意義〔J〕.解剖科學進展，2008;14(3)：284-6.

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