非酒精性脂肪性肝病患者肝臟脂聯(lián)素的表達與病理改變的關系

馬 紅 郭春花 楊香玖

(廈門大學附屬中山醫(yī)院內分泌科 福建醫(yī)科大學廈門中山教學醫(yī)院， 福建 廈門 361004)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是與肥胖密切相關的一種常見肝臟疾病〔1〕，其病理改變包括單純性脂肪肝和脂肪性肝炎，盡管單純性脂肪肝預后一般是良好的，但是有些病人可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，后者可進一步發(fā)展為肝硬化和肝功能衰竭〔2〕。NASH的發(fā)病機制目前還不十分清楚。脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的一種具有抗糖尿病和抗動脈硬化作用的脂肪細胞因子〔3〕。它可以增強肝臟胰島素作用的敏感性，降低脂質在巨噬細胞的堆積及具有抗炎作用〔4～6〕。研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以改善非酒精性脂肪肝NAFLD肝細胞的脂肪變性和炎癥〔7〕。Aygun等〔8〕報道，合并有肝酶升高的NASH病人及炎癥程度嚴重的NASH病人的血清脂聯(lián)素水平都降低。而Mehmet等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，血清脂聯(lián)素水平與NASH患者的肝臟組織學病變程度沒有相關性。脂聯(lián)素通過與受體結合發(fā)揮作用，脂聯(lián)素受體包括脂聯(lián)素受體Ⅰ和受體Ⅱ，對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素受體Ⅰ在骨骼肌含量豐富，受體Ⅱ主要在肝臟表達〔10〕。本研究檢測了重度肥胖的NAFLD患者脂聯(lián)素在肝臟的表達，探討脂聯(lián)素在NAFLD發(fā)病中的可能作用。

1 對象與方法

1.1一般資料 因肥胖做胃旁路減肥手術的30例患者，行肝穿刺活檢診斷為NAFLD。所有病人均簽署知情同意書。對這些患者均詳細詢問病史及體格檢查，測量身高、體重，計算體重指數(shù)(BMI)。排除標準：有過量飲酒史的病人、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝病、肝豆狀核變性、Wilson病、糖原貯積病等。生化檢查包括谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、總膽紅素、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白、白蛋白、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)等。

1.2組織病理學檢查 對這些病人進行細針肝穿刺活檢后標本送檢進行常規(guī)肝臟組織學檢查。由一位肝臟病理學醫(yī)生根據(jù)Brunt標準〔11〕對NAFLD進行病理分級和分期。本研究中18例診斷為NASH，12例為非酒精性單純性脂肪肝。

1.3免疫組織化學染色 對肝臟脂聯(lián)素進行免疫組織化學分析。將5 μm的組織切片用二甲苯和梯度酒精進行水化，在3%的雙氧水中放置30 min抑制內源性過氧化物酶活性，然后在蒸餾水中浸10 min，再將標本用抗原修復液(DaKo,CA,USA)95℃孵育30 min。滴加封閉液Power block(BioGenex,San Ramon,CA,USA)孵育5 min以消除非特異性抗原活性，然后將標本加入一抗，4℃過夜。一抗為羊抗人脂聯(lián)素多克隆抗體(PBS稀釋為1∶100，R&D system, Mckinley Place, MN)。將組織切片用加0.1%吐溫-20的PBS液洗滌2次，然后加入生物素標記的二抗室溫孵育30 min。脂聯(lián)素的二抗為兔抗羊IgG(Novus Biologicals, Littleton,CO)。顯色使用標記的生物素--抗生物素染色法。將標本用蒸餾水洗滌后，用蘇木精復染，然后干燥，封片、鏡檢。由兩位對患者臨床資料不知情的病理科醫(yī)生，用奧林帕斯BX51顯微鏡進行觀察。標本的強度采用10個隨機顯微鏡視野半定量方法測得。分別用1,2,3代表弱、中等、強。設置不加一抗的組織切片作為陰性對照。

2 結 果

2.1臨床和生化資料 30例肥胖的NAFLD患者(NASH組18例，單純性脂肪肝組12例)的臨床和生化資料見表1。兩組研究對象均為重度肥胖。兩組的年齡和性別分布匹配。NASH組有7例患者并發(fā)糖尿病(38.9%)，單純肝細胞脂肪變性組有3例糖尿病(27.3%)(P>0.05)。與單純性脂肪肝組相比，NASH組血漿ALT水平更高(P=0.025),HDL-C水平較低(P<0.001)。其他生化指標，包括AST、ALP、總膽紅素、總蛋白、白蛋白、TC、LDL-C、TG和FPG水平兩組的結果均無統(tǒng)計學差別(表1)。

2.2肝臟病理和免疫組織化學染色結果 單純性脂肪肝病理表現(xiàn)為不同程度的肝細胞脂肪變性，但無其他明顯組織學改變，即無炎癥、壞死和纖維化。NASH組患者的肝臟病理表現(xiàn)為肝細胞大泡性或以大泡性為主的混合性脂肪變性，伴有不同程度的炎性細胞浸潤和纖維化(見表2)。免疫組織化學染色結果顯示脂聯(lián)素主要在肝血竇和門脈血管的內皮細胞表達。其表達水平在NASH患者中明顯低于單純性脂肪肝組(圖1)。

表1 NAFLD患者臨床和生化資料±s)

表2 肝臟病理和免疫組織化學染色結果±s)

圖1 肝臟組織的脂聯(lián)素免疫組化染色結果(DAB，×400)

2.3脂聯(lián)素表達與肝組織病理變化的相關性 Spearman相關分析結果顯示脂聯(lián)素的表達強度與肝細胞的炎癥程度呈負相關(r=-0.368,P=0.045),與纖維化程度也呈負相關(r=-0.380，P=0.038)。脂聯(lián)素表達與肝細胞脂肪含量百分比的相關系數(shù)為-0.31(P<0.09)。脂聯(lián)素表達與HDL-C濃度及其他生化指標無相關性。

3 討 論

本研究結果表明在肥胖的NAFLD患者中，與單純性脂肪肝組的患者相比，NASH組脂聯(lián)素在肝臟的表達明顯降低。脂聯(lián)素在肝臟的表達水平與肝組織炎性細胞浸潤程度、纖維化程度呈負相關。

Hui等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)NAFLD組血清脂聯(lián)素濃度低于單純性脂肪肝組，而且血清脂聯(lián)素水平與肝細胞脂肪變性程度和炎癥程度獨立相關，但與纖維化程度無相關性。在另一項研究中，Bugianesi等〔13〕發(fā)現(xiàn)NAFLD患者與對照組相比，其血漿脂聯(lián)素濃度明顯下降，脂聯(lián)素水平的降低與肝細胞脂肪含量有明顯的相關性，但與肝細胞的炎癥程度和纖維化程度并不相關。鐘炳武等〔14〕的研究表明在肥胖患者中，血清脂聯(lián)素水平正常，與收縮壓、HDL-C 相關。有研究顯示在用CCl4處理過的小鼠肝臟中GBP28/脂聯(lián)素的表達明顯升高，該結果提示脂聯(lián)素在肝臟的組織損傷和炎癥反應的修復過程中起一定作用〔15〕。另一項在NAFLD患者的研究中，發(fā)現(xiàn)NAFLD患者脂聯(lián)素和脂聯(lián)素受體Ⅱ在肝臟的表達水平比單純性脂肪肝患者明顯降低〔16〕。本研究結果表明，在肥胖的NAFLD患者中，NAFLD組脂聯(lián)素在肝臟的表達比單純性脂肪肝組明顯下降。

本實驗結果提示肝臟的脂聯(lián)素不是由肝臟產生，而是從血循環(huán)中攝取來的。因此，有理由認為肝臟的脂聯(lián)素表達水平與血循環(huán)中的脂聯(lián)素濃度是有相關性的。本研究結果沒有測定患者的血清脂聯(lián)素水平，這是本研究的一個不足之處。而Kaser等〔17〕在對NAFLD病人的研究中，沒有發(fā)現(xiàn)血清脂聯(lián)素與肝臟脂聯(lián)素mRNA表達的相關性。當然，這是一個基于小樣本的研究得出的結論。脂聯(lián)素在肝臟表達的調控因素還需要進一步深入的研究。

本研究中Spearman相關分析結果表明脂聯(lián)素的表達強度與肝臟的炎癥程度和纖維化程度呈負相關，說明脂聯(lián)素在肝臟的表達與非酒精性脂肪肝肝臟病理變化有關。有多項研究提示脂聯(lián)素有抗炎〔6〕和抗纖維化的作用〔17〕。脂聯(lián)素通過抑制NF-κB的活性發(fā)揮抗炎作用〔18〕，通過降低轉移生長因子(TGF)在肝臟衛(wèi)星細胞的表達來抑制四氯化碳引起的肝臟纖維化〔17〕。本結果提示，在NAFLD患者中脂聯(lián)素表達下降，可能使其抗炎、抗纖維化作用減弱。

本研究還發(fā)現(xiàn)血HDL-C水平在NASH組是明顯下降的。有研究表明，脂聯(lián)素與脂代謝紊亂密切相關，血漿脂聯(lián)素濃度與HDL-C水平正相關〔19〕。最近，F(xiàn)umihiko等〔20〕報道脂聯(lián)素可以通過增加ABCA1旁路和apoA-1在肝臟的合成提高HDL水平。本研究中沒有發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素表達與HDL-膽固醇的相關性，可能與樣本量較少有關。

總之，本研究結果提示肥胖患者，脂聯(lián)素在肝臟表達水平的下降可能在NAFLD特別是從單純性脂肪肝到NASH的進展中起一定作用。

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