丁酸鈉對乳腺癌細胞MCF-7生長抑制的影響

蘇標+徐慶微+黃志力+張國祥

[摘要] 目的 探討丁酸鈉對乳腺癌細胞MCF-7生長的抑制作用。 方法 將乳腺癌細胞MCF-7常規培養至對數生長期，采用濃度為0、2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸鈉處理后，觀察對MCF生長的抑制作用。結果 濃度為2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸鈉處理的MCF-7細胞生長速度明顯慢于親本細胞，隨著濃度的增加呈減慢趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。濃度為5mmol/L的丁酸鈉處理后的MCF-7細胞克隆形成率明顯低于MCF親本細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。丁酸鈉處理的細胞G1明顯高于親本細胞，S期及G2/M期明顯低于親本細胞，凋亡細胞百分比明顯高于親本細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。 結論 丁酸鈉可能是通過誘導MCF-7細胞凋亡而起到逆轉其惡性生物學行為的作用。

[關鍵詞] 丁酸鈉；乳腺癌細胞；MCF-7；抑制

[中圖分類號] R737.9???[文獻標識碼] A???[文章編號] 2095-0616（2014）11-33-04

The inhibitory effect of sodium butyrate on MCF-7 breast cancer cells growth

SU?Biao??XU?Qingwei??HUANG?Zhili??ZHANG?Guoxiang

Department of General Surgery, Guangzhou City Liwan District People's Hospital, Guangzhou 510000, China

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of sodium butyrate on the growth of breast cancer cells MCF-7. Methods Breast cancer MCF-7 cells were cultured to logarithmic growth phase, they were processed with sodium butyrate, 0, 2.5, 5.0, 10.0mmol/L were the concentration, the growth inhibition of MCF was observed. Results The growth rate of MCF-7 cell processed with the sodium butyrate with the Concentration 2.5, 5.0, 10.0mmol/L was significantly slower than that of the parent cell, the growth rate with increasing concentration was slower, there was the significant difference(P＜0.05). The colony efficiency of MCF-7 cells processed with the sodium butyrate with the concentration 5mmol/L was significantly lower than that of the parental cells, there was the significant difference (P＜0.05). After processed with sodium butyrate, Cell G1 was significantly higher than the parental cells, S phase and G2 / M phase were significantly lower than the parental cells, the percentage of apoptotic cells was significantly higher than the parental cells, there was the significant difference(P＜0.05). Conclusion Sodium butyrate may be by inducing apoptosis in MCF-7 cells and play a reversal of its role in the m alignant behavior.

[Key words] Butyrate; Breast cancer cells; MCF-7; Suppression

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，嚴重影響女性的健康，近年來在世界范圍內乳腺癌的發病率呈逐年上升趨勢并且年齡逐漸年輕化[1-2]。丁酸鈉為短鏈脂肪酸丁酸的鈉鹽，主要通過改變組蛋白的乙酰化程度來改變染色質結構，參與多種基因的表達[3]。部分食物在人體沒有經過小腸消化，厭氧菌對上述食物中的碳水化合物及蛋白分解發酵后即可產生丁酸鈉，其在結腸上皮細胞的能量來源中占有較大比例，使結腸肽或生長因子的釋放受到刺激，對結腸黏膜血供進行調節，促進上皮細胞的增殖[4]，但有報道表明，丁酸鈉還具有抑制腫瘤細胞增殖及誘導細胞衰老與凋亡等作用[5-8]。筆者為了探討乳腺癌

細胞MCF-7生長是否會受到丁酸鈉的抑制，將乳腺癌細胞MCF-7采用丁酸鈉處理后對其細胞生長速度、倍增時間等進行觀察，現報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

本研究時間段為2013年5~12月。乳腺癌細胞MCF-7提供單位：中科院上海細胞庫；丁酸鈉提供單位：美國Sigma公司，CAS號：156-54-7，采用高壓滅菌的蒸餾水溶解，配成0、2.5、5.0、10.0mmol/L濃度，分裝后放置于-20℃凍存；胎牛血清提供單位：杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶、EDTA等提供單位：德國Merk公司；蛋白酶K、DNA分子量Markers等提供單位：美國Invitrogen公司，其余試劑均為國產分析級。

1.2?研究方法

1.2.1?生長速度和倍增時間的檢測?常規消化對數生長期的MCF-7細胞，接種于24孔培養板，每孔接種1×104個細胞，共接種72孔，在溫度為37℃、5%CO2孵箱中孵育24h。處理細胞的丁酸鈉的濃度分別為0、2.5、5.0、10.0mmol/L。每組藥物濃度均設3個復孔，各濃度計數3孔細胞/d，采用Microsoft Excel軟件計算各濃度各時間的平均值及標準差。做細胞生長的柱形圖，將培養時間（d）及細胞數分別作為柱形圖的橫縱坐標，按照以下公式計算倍增時間：TD（倍增時間）=t（Nt與N0間隔時間）*log2/[logNt（培養后的細胞數）-logN0（起始時間細胞數）]。

1.2.2?平板克隆形成率?取對數生長期的MCF-7親本細胞接種于6個平皿，每平皿接種1×102個細胞，在溫度為37℃、5%CO2條件下培養24h，將其中3個平皿的細胞用濃度為5.0mmol/L的丁酸鈉處理24h，同時設對照組，即剩余的3個平皿不采用丁酸鈉處理，在相同條件下培養21d，固定使用甲醛溶液，Gimesa染色。將平均克隆數計算出來并根據平均克隆數及接種細胞數得出克隆形成率（為平均克隆數與接種細胞數的比值與100%的乘積）。

endprint

1.2.3?細胞周期及凋亡的測定?取對數生長期MCF-7親本細胞常規消化，接種于6個培養瓶，每瓶接種5×105個細胞，在37℃，5%CO2的條件下培養24h后，將其中的3瓶細胞采用濃度為5.0mmol/L的丁酸鈉進行處理，同時設對照組，即為剩余的3瓶細胞，在相同條件下培養24h后收集不同處理組的細胞。在4℃的條件下細胞采用濃度為70%的乙醇固定過夜。用預冷的PBS在染色前洗3次。將200μL濃度為1mg/mL的 RNase A加入，在37℃條件下溫育30min。將800μL濃度為100ng/mL的碘化丙錠（PI）染色液混勻后加入，在避光4℃條件下放置30min。DNA的含量采用流式細胞儀（CouIter-profilo II型）測定，細胞周期分布及細胞凋亡情況采用Multicycle DNA含量及細胞周期分析軟件分析。

1.3?觀察指標

（1）MCF-7細胞生長速度，倍增時間；（2）克隆形成率；（3）細胞周期：G1、S期、G2/M期；（4）凋亡細胞百分比。

1.4?統計學處理

將研究所得數據輸入計算機，建立數據庫，采用SPSS16.0統計學軟件處理，符合正態分布的計量資料采用（）表示，采用F檢驗對多組間差異進行比較，采用t檢驗對兩組間差異進行比較，采用x2檢驗對計數資料組間差異進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?對MCF-7細胞生長速度及倍增時間的影響

2.1.1?對MCF-7細胞生長速度的影響?濃度為2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸鈉處理的MCF-7細胞生長速度明顯慢于親本細胞，隨著濃度的增加呈減慢趨勢，差異有統計學意義（F=17.15，P＜0.05）。見圖1。

圖1??丁酸鈉對MCF-7細胞生長的抑制作用

2.1.2?各種濃度丁酸鈉對MCF-7倍增時間的影響?MCF-7親本細胞的倍增時間為（30.1±2.6）h、2.5mmol/L丁酸鈉處理的MCF-7倍增時間為（65.8±4.7）h、5mmol/L丁酸鈉處理的MCF-7倍增時間為（171.6±9.5）h、10mmol/L丁酸鈉處理的MCF-7倍增時間為（304.2±13.1）h。各種濃度丁酸鈉處理的MCF-7倍增時間均明顯高于MCF-7親本細胞的倍增時間，差異有統計學意義（F=12.86，P＜0.05），并且倍增時間隨著丁酸鈉濃度的升高也呈現升高趨勢。

2.2?對MCF-7細胞克隆形成率的影響

MCF-7親本細胞平均形成（69.5±10.4）個細胞克隆，平均細胞克隆形成率為69.5%，而濃度為5mmol/L的丁酸鈉處理后的MCF-7細胞平均形成（17.8±3.2）個細胞克隆，平均細胞克隆形成率為17.8%，濃度為5mmol/L的丁酸鈉處理后的MCF-7細胞克隆形成率明顯低于MCF親本細胞，差異有統計學意義（x2=9.37，P＜0.05）。

2.3?對MCF-7細胞細胞周期的影響

丁酸鈉處理的MCF-7細胞G1明顯高于親本細胞，S期及G2/M期明顯低于親本細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.4?對MCF-7細胞凋亡的影響

丁酸鈉處理的凋亡細胞百分比明顯高于親本細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1??對MCF-7細胞細胞周期的影響（）

組別 G1 S期 G2/M期

親本細胞 52.6±1.3 37.9±0.4 10.3±0.9

處理后的MCF-7細胞 81.3±0.7 13.2±0.2 5.4±0.6

t 6.07 3.71 4.58

P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2??對MCF-7細胞凋亡的影響

組別 總細胞數 凋亡細胞數 凋亡細胞百分比（%）

親本細胞 10 798 18 0.17

丁酸鈉處理的細胞 9352 1816 19.42

x2 11.38

P ＜0.05

3?討論

腫瘤治療方法的療效通常取決于兩個關鍵因素，即治療靶點的有效性和對腫瘤細胞的選擇性[9]。現行腫瘤化療、放療以細胞的核苷酸、蛋白代謝或DNA為治療作用靶點，沒有選擇性，難以避免毒副作用強，宿主與腫瘤之間治療窗小的缺點。為此，針對新的分子靶點設計高效、低毒的腫瘤治療新方法，已成為目前腫瘤治療領域發展的主導趨勢[10-12]。尋找腫瘤細胞特異性分子靶點是本領域目前待解決的關鍵難題。體外培養的惡性腫瘤細胞生長速度較快，倍增時間較短及無限的體外傳代能力是其典型的惡性生物學特征，所以，減慢細胞的生長速度及延長倍增時間等策略對體外培養的惡性腫瘤細胞來講是效果較好的腫瘤治療方法[13-14]。

本次研究表明，濃度為2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸鈉處理的MCF-7細胞生長速度明顯慢于親本細胞，隨著濃度的增加呈減慢趨勢，濃度為5mmol/L的丁酸鈉處理后的MCF-7細胞克隆形成率明顯低于MCF親本細胞，丁酸鈉處理的細胞G1明顯高于親本細胞，S期及G2/M期明顯低于親本細胞，丁酸鈉處理的凋亡細胞百分比明顯高于親本細胞，以上差異均有統計學意義（P＜0.05）。謝瑞蓮等[7]觀察組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉對人乳腺癌細胞株MCF-7細胞增殖的影響，結果表明，采用不同濃度丁酸鈉處理乳腺癌MCF-7細胞后均有顯著的抑制增殖作用，并且作用時間越長、所用丁酸鈉劑量越大則抑制MCF-7細胞作用越明顯，細胞出現凋亡形態變化，該研究結果與本次研究結果具有一致性。MCF-7細胞為人乳腺癌細胞株，生長增殖旺盛，由研究結果可見，其一，乳腺癌細胞MCF-7采用丁酸鈉處理后能夠抑制其生長。計算克隆形成率以便更好的了解細胞的群體依賴性及增殖能力，根據腫瘤細胞中惡性程度不同，惡性程度較高的與惡性程度低的比較明顯較強[15-16]；其二，采用丁酸鈉處理乳腺癌細胞MCF-7后降低了平均細胞克隆率，使其增殖能力受到抑制。丁酸鈉是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，使癌細胞乙酰化的平衡狀態被打破，癌細胞發生凋亡。其三，采用丁酸鈉處理后明顯影響了MCF-7細胞的細胞周期分布，G1期細胞升高，S期細胞降低，提示采用丁酸鈉處理后抑制了細胞的DNA合成，將其阻滯在G1期，使惡性增殖受到抑制。反應惡性腫瘤惡性生物學活性的各項指標中生長速度、倍增時間、克隆形成率及細胞周期分布變化等具有重要的意義[13，17-18]。細胞凋亡會影響個體的發育及某些疾病的發生發展，腫瘤是一種凋亡受阻性疾病，所以，在腫瘤的治療方面阻滯細胞的增殖周期，使其增長受到抑制，誘導腫瘤細胞凋亡增加為一個抗癌藥物研究的重要方向。其四，丁酸鈉處理乳腺癌細胞MCF-7能使其惡性生物學行為受到抑制。總之，丁酸鈉可能是通過誘導MCF-7細胞凋亡而起到逆轉其惡性生物學行為的作用。

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（收稿日期：2014-04-14）

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（收稿日期：2014-04-14）

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