人羊水特異蛋白質組學的探討研究

朱斌 陳芳 侯常 黎麗紅 黃素華

羊水對于胎兒的正常發育至關重要，其生成量和成分與胎兒的發育、胎盤和羊膜腔的功能密切相關[1］。羊水中蛋白質組學研究亦成為近年研究熱點。本研究初步觀察了在羊水中特異表達的蛋白質及高表達的蛋白質，旨在為妊娠相關疾病的發生、發病機制的探索研究提供理論依據，現報告如下。

材料與方法

一、試劑及儀器

1.試 劑

主要有：ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit血清高豐度蛋白去除試劑盒、四甲乙二胺（Sigma，美國），固相化pH 4～7、24 cm梯度干膠條、Bradford染液（Bio-Rad，美國），丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、甘氨酸十二烷基磺酸鈉（SDS）、尿素、CHAPs、過硫酸銨、碘乙酰氨、二硫蘇糖醇（Amersham Pharmacia Biotech，瑞典），一氯乙腈（成都貝斯特）。

2.儀 器

包括：IPGphor3等電聚焦儀、EttanDALT垂直電泳槽、Image scanner掃描儀、超聲儀（GE，美國），Autoflex speed？MALDI-TOF質譜儀（Bruker Dalton，美國），冷凍離心機（中國科學院武漢科學儀器廠）等。

二、蛋白樣品的制備

選擇3名正常妊娠晚期（37周）孕婦，征得其知情同意后，以羊膜穿刺法采集3份羊水標本，每份5 ml，同時以肘部穿刺取靜脈血標本3份，每份5 ml。所采集的標本分別在4℃、16 000×g離心15 min，取上清，0.4μm過濾后分裝， -70℃保存。離心超濾濃縮樣品，ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit試劑盒去除血清高豐度蛋白質，加入4倍體積丙酮，-20℃沉淀過夜。沉淀所得到的蛋白于4℃、12 000×g離心20 min，棄上清，晾干，-80℃凍存備用。用Bradford法定量蛋白質濃度。

三、雙向凝膠電泳及圖像分析

將去除高豐度蛋白的蛋白團塊重溶。24 cm干膠條在含100μg蛋白質樣本和水化液的460μl混合液中20℃水化10～12 h。將膠條放入等電聚焦盤中加電壓聚焦。第一向等電聚焦電泳 （IEF）后，待膠條平衡，再進行12%的聚丙烯電泳酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電泳所得的雙向凝膠用雙胺硝酸銀法染色及考馬斯亮藍染色，Imagescanner掃描儀進行透射掃描，獲得的數字化圖像運用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件進行蛋白質點的檢測、量化、背景扣除、點的匹配。著重選擇pH4～7，分子量10～55 KDa區域進行觀察，從羊水中找到僅在羊水中表達的蛋白質點及在羊水中表達量高于血清2倍以上的蛋白質點，隨機選取重復性和分辨率較高的10個差異蛋白質點行基質輔助激光解吸/離子化飛行時間質譜 （MALDI-TOF/TOFMS）鑒定。

四、MALDI-TOF/TOF-MS分析

選取行MALDI-TOF/TOF-MS分析的蛋白質點后行挖點、脫色、還原、烷基化、酶解、樣品回收及脫鹽處理、肽段提取后點靶上機，使用Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF質譜儀進行質譜分析。利用flexAnalysis軟件過濾基線峰、識別信號峰。利用Mascot軟件搜索NCBI及Uniprot數據庫，尋找匹配的相關蛋白質，同時查詢其功能，明確鑒定的蛋白質為何種蛋白質。

結 果

一、高豐度蛋白去除后雙向凝膠電泳分析結果

在pH 4～7、分子量10～55 KDa的區域中，羊水及血清的蛋白質位點分布大部分相同，血清組的斑點多于羊水組（見圖1A、B）。經ImageMaster 2D platinum 5.0軟件分析，羊水中約有（613±29）個蛋白質點，血清中約有（785±64）個蛋白質點，羊水中特異表達的蛋白點約50個（見圖1C），羊水中表達量高的蛋白點約50個（見圖1D）。

圖1 去除高豐度蛋白后的雙向凝膠電泳分析結果

二、MALDI-TOF/TOF-MS分析結果

隨機選取重復性和分辨率較高的10個濃度差異的蛋白質斑點行質譜分析鑒定，質譜分析結果見圖2及表1。

討 論

羊水作為胎兒生長發育最為重要的因素之一，在多種妊娠疾病的發生中有重要作用。蛋白質組學是繼人類基因組計劃完成后的新興學科[2］。隨著人類蛋白質組學組織（HUPO）的正式成立，蛋白質組學蓬勃發展，滲透到各個學科。近年來，國內外均有學者對妊娠婦女血液、羊水進行了蛋白質組學的研究，探索新的妊娠蛋白和疾病特異蛋白，以及蛋白質在妊娠相關疾病發生、發展中的相互作用。然而，目前的多數研究集中于尋找羊水中特異性的差異蛋白，筆者前期經nano LC/MS/MS對羊水的蛋白組學分析，已經發現羊水中人62種特異性蛋白[3］。本次通過比較Anderson等[4］和Michel等[5］的結果，新檢測到了22種僅在AF中表達的蛋白，其中14種是分泌型蛋白，其余8種分布于細胞膜、細胞質和細胞核。羊水特異性蛋白斑點約50余個，與此前nano LC/MS/MS的結果相符，故本研究不行此類斑點的質譜分析。

圖2 3種在羊水和血清中呈濃度差異表達的蛋白質

表1 10個在羊水及血清中呈濃度差異表達的蛋白質斑點質譜分析結果

本研究初步探討在羊水和血清中均有表達，但羊水中表達量明顯要高于血清的一些蛋白質。研究初步挑選其中10個重復性和分辨率較高斑點行質譜鑒定，檢索UniProt等在線蛋白數據庫，除2個斑點為細胞膜及細胞質蛋白外，余均為分泌型蛋白質。這些蛋白的已知功能如下：硫酸類肝素蛋白多糖（HSPG2）是基底膜的主要成分，對心臟發育及血管調節起著重要作用，此類蛋白質缺乏可導致常染色體隱性遺傳病侏儒綜合征的發生[6］。絨毛膜生成激素（CSH1）具有刺激泌乳、促進胎兒生長及新陳代謝等作用[7］。載脂蛋白AI為雙超螺旋模型的溶液結構B鏈，參與膽固醇的轉運，使其從組織中轉運至肝臟。因其影響膽固醇代謝，在HDL缺乏癥及淀粉樣變中起著重要的作用，其缺乏可引起早發冠心病，肝、脾腫大，復發性周圍神經病變，進行性肌肉萎縮和無力，其突變可致淀粉樣多神經病腎病、家族性淀粉樣多神經病[8-9］。AMBP蛋白是α1微球蛋白前體，具有抑制胰蛋白酶、纖溶酶、粒細胞前溶酶體酶及草酸鈣結晶的作用[10］。另外，胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBP）具有延長胰島素樣生長因子的半衰期，調節IGF的促進生長作用[11］。載脂蛋白E與胎兒生長有一定關系[8］。硫氧還原蛋白過氧化物酶2（PRDX2），與細胞氧化還原調節有關，在清除新陳代謝過程中產生的過氧化物起著重要的作用，通過調節細胞內過氧化氫的濃度，誘使生長因子和TNF-α的信息傳導[12］。BPIFA1蛋白與接觸刺激物后引起的氣道炎癥有一定的關聯，與上呼吸道的天然免疫有一定關系。亦在腫瘤的演化進展起著一定的作用[13］。補體因子B是補體系統的替代途徑，被D因子激活成2個片段Ba、Bb，Bb結合3b因子產生C3或C5轉化酶，對B細胞的增殖及分化起著一定作用，Ba的作用與此相反，與溶血性尿毒綜合征非典型4（AHUS4）有關[14］。羊水的某些蛋白質表達可反映妊娠生理或病理狀態，可能有助于妊娠相關疾病如胎兒宮內生長受限、子癇前期、早產、宮內感染甚至羊水栓塞等的早期診斷。本研究中在羊水表達水平偏高的蛋白質是否可提供某種診斷依據還待進一步研究證明。此外，鑒于本研究僅采用質譜蛋白鑒定策略，今后將對羊水中呈差異表達的蛋白質采用免疫印跡或其他的方法行進一步驗證，以確定其是完整的蛋白還是片段蛋白。

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