異體骨髓間充質干細胞聯合自體PRP促進皮膚慢性潰瘍創面愈合的實驗研究

王和庚 黎洪棉 田舉 趙培冉 梁雙武

皮膚慢性潰瘍在臨床上極為常見。老年患者一般情況差，基礎疾病多，細胞增殖和再生受限，創面修復和治療較為棘手。組織工程化人工皮膚的構建和應用為臨床大面積皮膚缺損的修復治療提供了新的途徑和方法。骨髓間充質干細胞（BMSC）是一種具有多項分化潛能的細胞，來源豐富，分離培養容易，已成為組織工程研究中常用的種子細胞[1-4］。近年的研究表明其對心、肺、皮膚、肌肉等組織創傷具有促進愈合和功能修復的作用[5-6］。富血小板血漿（PRP）是通過離心分離自體全血而得到的血小板濃縮物，經激活后能釋放出大量高濃度的生長因子，刺激細胞增殖分化并促進軟組織的修復[6］。本研究在前期對間充質干細胞體外分離培養與細胞標記等研究基礎上，體外培養異體BMSC，并與自體PRP聯合應用于皮膚慢性潰瘍的治療，以觀察兩者是否有協同作用[7］。

材料與方法

一、材料和試劑

1.實驗動物

健康成年SD大鼠17只，6～8周齡，體質量約150 g，雌雄不限，由南方醫科大學實驗動物中心提供，實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

2.主要試劑及儀器

包括DMEM、胎牛血清（美國Gibco），地塞米松、胰島素、吲哚美辛、胰蛋白酶、茜素紅、油紅O、DiI、二甲亞砜、異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）、轉化生長因子（TGF）-β1、阿爾辛藍、羊抗兔IgG-FITC、羊抗鼠IgG-cy3（美國Sigma），CO2恒溫培養箱（德國HERABUS），兔抗鼠CD29、CD44抗體（武漢博士德），外科用凍干人纖維蛋白原及溶解液、外科用凍干人凝血酶（華蘭生物）。

二、方 法

1.BMSC的分離、培養、傳代與鑒定

取1只SD大鼠，行頸椎脫位法處死，于無菌條件下取出雙側股骨，去除股骨雙側干骺端，用DMEM高糖完全培養基沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞，以Ficoll液低速離心5 min，收集并計數有核細胞，加入等量含體積分數為10%胎牛血清的DMEM，稀釋后接種于75 ml培養瓶，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養箱中進行細胞培養，5 d后半量換液，以后每3 d換液1次，待細胞長至80%融合后消化傳代，以此獲得大鼠BMSC，采用第3代細胞進行實驗。BMSC生長至培養瓶底70%～80%面積時，改用向脂肪細胞分化的誘導培養基（含10%胎牛血清，1μmmol/L地塞米松，10μmol/L胰島素，200μmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX）定向誘導，期間每2～3 d更換1次誘導培養基，誘導至第6 d后按半量換液，定向分化誘導2周后進行油紅O染色定性觀察體外誘導分化的結果。另取第3代BMSC接種培養，生長至瓶底70% ～80%面積時，改用向成骨細胞分化的誘導培養基（含10%胎牛血清、0.1μmmol/L地塞米松、50μmol/L抗壞血酸和10 mmol/L的β-磷酸甘油）定向誘導，3周后行茜素紅染色定性觀察誘導結果。另取第3代人BMSC培養生長至培養瓶底100%面積時改用向軟骨細胞分化的誘導培養基（含10%胎牛血清、10μg/L TGF-β1、6.25 mg/L胰島素、6.25 mg/L轉鐵蛋白、50μmol/L抗壞血酸-2-磷酸酯）定向誘導，每2 d更換1次誘導培養基，定向誘導14 d后行阿爾辛藍染色，定性觀察誘導分化結果。取第3代ADSC爬片行CD29、CD44的免疫細胞熒光染色，并計算CD分子表達呈陽性的細胞比例。

2.DiI標記BMSC

參照說明書的方法，將收集細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗、離心2次，加入無血清DMEM制成細胞懸液，以109/L密度加入5μl的DiI溶液，37℃下孵育25 min，1 200 r/min離心5 min，PBS清洗、離心2次，加入上述完全培養基中，熒光顯微鏡觀察細胞顯色情況，置于37℃、5%CO2培養箱培養48 h，所得BMSC用于移植。

3.PRP的分離、提取

抽取同一只SD大鼠的全血10 ml，枸櫞酸二鈉抗凝，采用改良的Appel法分離、提取PRP備用，同時進行全血及PRP血小板計數，以確保PRP中血小板的數量是全血的4倍以上[7］。

4.大鼠創傷模型制作及治療干預

取16只SD大鼠，以30 mg/kg戊巴比妥麻醉，在其背部脊柱一側旁距2 cm左上方處，利刀全層切除皮膚，形成一個直徑2 cm、面積24 cm2的圓形全層皮膚切除創面（A組）。同法在左下方（B組）、右上方（C組）及右下方（D組）各對稱部位皮膚作同樣大小的創面。創面暴露2周后進行治療，凡士林紗布覆蓋創面。將標記好的5×106個BMSC制成細胞懸液，自體PRP制成凝膠狀，各組治療方案為：A組為局部注射異體BMSC懸液+PRP，B組為局部注射單純異體BMSC懸液；C組為局部注射單純PRP；D為局部注射等量生理鹽水。7、14 d頸椎脫位法各處死8只小鼠，采集標本觀察結果。采用大體觀察、觀察傷口的生長情況、傷口滲出量、損傷處的炎癥反應；取得標本后，以10%甲醛固定，蘇木素-伊紅染色及免疫組織熒光染色觀察創面愈合情況。

三、統計學處理

使用SPSS 13.0軟件進行統計處理，所有數據至少進行3次獨立實驗。計量資料以s表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、形態學及多向誘導分化

細胞約24～48 h貼壁，初為淋巴細胞樣小圓細胞，24～48 h后貼壁細胞明顯增多，并開始分裂增殖，圓形細胞變形伸出偽足，約7 d長滿培養瓶底面積的70% ～80%，此時細胞逐漸融合成單層，細胞形態為梭形、多角形，呈集落狀生長，并出現核分裂相。細胞圍繞集落中央呈島狀分布，并分泌大量基質。傳代后的細胞形態與原代相似，以梭形為主，但生長增殖較快。隨著傳代次數的增多，細胞變為形態均一、排列更有序的成纖維細胞樣（圖1A）。第3代細胞經成脂誘導14 d，可見細胞內有透亮的脂滴形成，油紅O染色可見脂滴被染成鮮紅色（圖1B）；成骨誘導3周，可見鈣化結節樣改變，茜素紅染色結節呈紅色（圖1C）；成軟骨誘導2周后，可見高度聚集生長的細胞團，呈斑片狀或結節狀，周圍細胞呈放射狀，阿利辛藍染色提示結節及周邊聚集的細胞呈藍色（圖1D）。

圖1 第3代大鼠BMSC形態學觀察結果

二、Dil標記及免疫熒光染色

DiI標記后行臺盼藍染色，見BMSC活力好，僅偶見藍染細胞，熒光顯微鏡下觀察，見全部BMSC標記后胞漿及胞膜均顯紅色熒光（圖2A）。所標記的BMSC呈梭形，胞漿豐富，保持了良好的正常形態，DiI標記陽性率為100%。DiI標記后早期細胞形態呈熒光環狀，48 h后細胞中熒光顆粒增多，熒光增強，細胞標記后7 d內未見熒光明顯減弱，但細胞核未染熒光。標記前、后的細胞形態無明顯差別。第3代BMSC行免疫熒光染色結果表明，CD29和CD44免疫熒光染色呈陽性（圖2B、C）。

圖2 第3代大鼠BMSC DiI標記及CD29和CD44免疫熒光染色結果

三、大體觀察

16只SD大鼠均單籠飼養，進食正常，全部存活。治療7 d后，大鼠體質量（150±1）g，與術前體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。14 d時，小鼠體質量（159.05±1.89）g，比手術前有明顯增長（t=12.728，P＜0.001）。在治療后7 d采集標本時，4組創面均已完全愈合，但愈合創面均低于周圍正常皮膚，凹面程度不同，光滑不一。治療14 d后，A組創面與周邊組織連接程度較對照組緊密。B組和C組與周邊組織有一定的連接，而D組尚有凹面。

四、組織學觀察

治療7 d后，可見淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，移植物與深筋膜貼近而存在。隨植入治療后時間的延長，在移植物與深筋膜之間，可見到由大量呈較大橢圓核、常染色質、著色淡、核仁清楚、Ⅰ型膠原陽性的、功能活躍的成纖維細胞，豐富的血管以及大量粗細不一的膠原纖維束等組成的新生真皮結締組織。治療14 d后真皮結締組織更明顯。A、B、C組不同時間點的新生真皮組織，均明顯厚于D組，3組中功能旺盛的成纖維細胞，特別是I型膠原陽性的成纖維細胞、血管及膠原纖維均明顯多于D組。在A、B、C 3組中則以A組新生真皮組織最厚，見圖3。

圖3 治療7、14 d后各組創面病理組織學切片（蘇木素-伊紅染色，×200）

五、免疫熒光染色

治療后7、14 d組織切片A、B組免疫熒光染色均可見DiI染色陽性的細胞，胞膜呈紅色熒光，標記的BMSC在創面邊緣和創傷局部聚集，而C、D組未見有BMSC在創面邊緣和創傷局部聚集，見圖4。

圖4 治療7、14 d后各組創面免疫熒光染色結果（DiI染色，×100）

討 論

隨著我國工業化的不斷發展以及社會人口老齡化，各種原因造成的皮膚和軟組織慢性潰瘍等難愈性創面逐年增多。這類患者往往需要長期住院、換藥，甚至經過多次手術卻療效欠佳，不僅消耗了大量醫療資源，而且容易引發醫患糾紛，導致嚴重的社會問題。

創面愈合是一個復雜而有序的生物學過程，呈現高度的整體性和網絡性。在機體的調控下，炎性細胞、修復細胞、細胞外基質及細胞因子等多因素相互協調，共同參與創面愈合。一般認為創面修復緩慢甚至修復停止的原因主要有以下4種：①傷口感染或壞死組織存在；②傷口血供微循環障礙；③局部生長因子數量減少，活性降低或多種生長因子網絡調節失控；④修復細胞支架改變和過度凋亡，細胞膜上受體結構變化，導致生長因子與受體之間失偶聯。移植補充新鮮的創面修復細胞和有活性的生長因子是目前慢性潰瘍創面修復領域研究的重點和熱點。BMSC是存在于骨髓組織中的一類成體干細胞，具有較低的免疫原性方便、易分離擴增、可塑性強、離成熟細胞近等特點，是再生醫學中最有前途的種子細胞之一，特別是其跨胚層的分化潛能促使人們探討能否將BMSC進行誘導分化以重建受創皮膚的解剖結構和生理功能。隨著對BMSC研究的深入，現已證實BMSC在損傷等刺激下能參與多種組織的修復作用，但其機制尚未完全闡明[8-11］。本研究觀察到，BMSC對創面愈合也有一定的促進作用。識別外源性的BMSC，是干細胞體內移植研究的重要環節。筆者通過多次實驗，證明DiI標記的陽性率可達（98.5±2.2）%，可作為體外培養的間充質干細胞所特有的標記物以區分在體細胞。本研究在治療后7、14 d時，新生肉芽組織中均可見有帶DiI標記的細胞分布，表明BMSC在損傷的皮膚組織內能夠存活并能向周圍組織遷移。另外，本研究顯示經BMSC治療后創面愈合速度提高，愈合質量改善，創面肉芽組織中成纖維細胞多，功能旺盛，血管密度大，治療組形成的新生表皮較厚，分層明顯。因此筆者認為，局部創面應用BMSC可以促進皮膚損傷修復并提高愈合質量，與Satoh等[12-14］研究結果一致。

PRP是血小板濃縮物，經激活后能釋放出大量高濃度的生長因子，可促進軟組織的修復。由于PRP來源于自體，無免疫排斥，制作簡單，不良反應少，近年來國外已有應用于牙周病、口腔種植、顱面及慢性潰瘍創面的研究報道。本研究顯示，單純的BMSC或單純的PRP對創面愈合也有一定的促進作用，但效果不如兩者聯合應用。其原因可能是，在創面愈合過程中，BMSC起到種子細胞的作用，在機體內環境的誘導作用下向組織細胞分化，而PRP則起到營養的作用。同時，PRP中各種高濃度有活性的生長因子可促進BMSC的增殖分化，增加修復細胞數量，這些修復細胞通過旁分泌和自分泌形式分泌生長因子又可以作用于周圍細胞及細胞自身，構成了一個良性循環，兩者聯合起到協同修復的效果。然而，由于細胞存在于三維立體空間中，不同濃度的細胞，其細胞與細胞間的作用不同，對于BMSC參與組織修復可能是通過創傷的刺激以及局部創面的“壁龕”促進BMSC趨化并誘導BAMSC向所需要的組織或細胞分化，其具體分子機制仍有待進一步研究。

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