17-DMAG對人結直腸癌裸鼠移植瘤微血管形成的抑制作用

廖堅松 陳煥忠 茹晃耀 柯尊富

我國結直腸癌的發病率持續上升，病死率較高。到目前為止，結直腸癌的發病機制尚未完全清楚，其治療效果仍不夠理想，腫瘤的復發和轉移是治療難點。既往的研究表明，結直腸癌的生長、轉移和復發均依賴于腫瘤新生血管的生成，故抑制腫瘤新生血管的生成可能成為結直腸癌治療的新方向[1］。內皮細胞生長因子（VEGF）是一種促腫瘤新血管生成的生長因子，其表達水平與腫瘤的惡性程度、轉移和微血管密度等呈正相關[2］。熱休克蛋白90（HsP90）抑制劑17-二甲基胺乙基-17-去甲氧基格爾德霉素（17-DMAG）是格爾德霉素的新一代衍生物，與上一代相比，17-DMAG的水溶性和生物利用度明顯提高[3］。筆者見有關17-DMAG抗腫瘤活性的研究較少，故觀察了17-DMAG對結直腸癌VEGF的表達和腫瘤微血管生長的影響，以探討其可能的抗腫瘤作用機制。

材料與方法

一、材 料

BALB/C-nu/nu裸鼠（SPF級）購于中山大學附屬第一醫院動物實驗中心，共24只，4～6周齡，體質量24～28 g，分籠飼養（每籠4只）。人結腸癌SW620細胞株由中山大學附屬第一醫院動物實驗中心提供并保存。17-DMAG購于北京啟維益成科技公司，溶解后配成2 g/L的儲存液，保存于-4℃冰箱。VEGF購于北京博奧森生物技術有限公司。血小板內皮細胞黏附分子（CD31）購于深圳華拓生物有限公司。

二、動物模型的制備

將人結腸癌SW620細胞株復蘇、傳代后進行常規收集，調整細胞終密度為5×107個/ml。于裸鼠左側肋腹部皮下接種，注射劑量為每只200μl，含細胞1×107個。術后精心飼養，每日觀察1～2次。一般于接種后4 d出現肉眼可見的腫瘤，隔日用游標卡尺測量腫瘤的大小，計算腫瘤體積：體積=0.52×長徑×短徑2。

三、實驗動物分組及取材

待裸鼠皮下腫瘤生長到體積約100 mm3時，隨機把裸鼠分為3組，每組8只：①17-DMAG組腹腔注射17-DMAG 25 mg/kg；②5-氟尿嘧啶（5-FU）組腹腔注射5-FU 20 mg/kg（最常用的結直腸癌化學治療藥）；③對照組腹腔注射生理鹽水10 ml/kg。3組均每周給藥3次，共4周。4周后采用頸椎脫臼法處死小鼠，剝取瘤組織，測量瘤體質量和體積，按以下公式計算抑瘤率：抑瘤率（%）=（對照組平均瘤質量-藥物組平均瘤質量）/對照組平均瘤質量×100%[3］。

四、檢測項目

1.檢測腫瘤組織微血管密度 （MVD）和VEGF

將瘤組織浸入10%甲醛固定，用石蠟包埋切片。切片后的一部分標本進行相關抗原免疫組織化學染色檢測CD31、VEGF，嚴格按試劑盒說明進行，各組標本同一批染色，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替Ⅰ抗作陰性對照。

MVD判斷標準：按Weidner等[4］推薦的方法，凡呈現棕色單個內皮細胞或內皮細胞簇均作為1個微血管計數.但肌層較厚及管腔面積大于8個紅細胞直徑的血管不計數。計數方法如下，首先用低倍鏡（10×10）掃視整張切片，確定微血管最密集的3個視野，然后在高倍鏡（10×40）視野范圍內計數所有染色的微血管。取3個視野計數結果的均數為該切片的微血管數[4］。

VEGF判斷標準：觀察棕黃或棕褐色顆粒的分布情況，細胞內有棕黃或棕褐色顆粒且強度高于背景的著色細胞為陽性細胞，無棕黃或棕褐色顆粒為陰性細胞。根據細胞染色強度分為4級，并分別計分：陰性為細胞無著色（0分），弱陽性為淺黃（1分），中度陽性為棕黃（2分），強陽性為棕褐（3分）。在每張切片上隨機選取10個視野（10×10），計數每一強度視野陽性細胞數所占的比率（F），計算每張切片的平均染色強度[5］。

2.蛋白印跡法檢測VEGF表達

切片后的另一部分標本保存于-20℃冰箱，用蛋白印跡法檢測腫瘤組織中VEGF的表達。按照Kong等[6］推薦的方法，用Image J1.43軟件進行分析，每組樣本重復3次，取3次均值。

五、統計學處理

使用SPSS17.0統計軟件處理數據。正態分布計量資料以ˉx±s表示，3組間比較采用方差分析，方差齊則再進一步采用LSD法進行兩兩分析，方差不齊則采用Tamhane's T2法。兩組抑瘤率比較采用t檢驗。P＜0.05具有統計學意義。

結 果

一、17-DMAG組、5-FU組及對照組移植瘤體質量、體積和抑瘤率比較

17-DMAG組、5-FU組在給藥結束后瘤體質量、瘤體積與對照組相比均明顯下降（P＜0.05）；17-DMAG組與5-FU組之間瘤體質量、瘤體積、抑瘤率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。方差分析結果顯示，3組瘤體質量比較的F=15.73、P=0.001，瘤體積的F=7.85、P=0.002。見表1。

表1 17-DMAG組、5-FU組及對照組移植瘤重量、體積及抑瘤率的比較

表1 17-DMAG組、5-FU組及對照組移植瘤重量、體積及抑瘤率的比較

注：與對照組比較，a為P ＜0.05

組 別 瘤體質量（g）瘤體積（mm3）抑瘤率（%）17-DMAG組（8只）1.15±0.49a 301.12±25.43a 48.43±6.75 5-FU組（8只） 1.22±0.58a 366.74±28.92a 45.29±8.34對照組（8只）2.23±0.66 968.68±118.66 0

二、17-DMAG組、5-FU組及對照組免疫組織化學染色檢測MVD、VEGF結果比較

17-DMAG組給藥結束后MVD、VEGF均較5-FU組及對照組低（P＜0.05），方差分析結果顯示，3組MVD比較的F=10.69、P=0.001，VEGF比較的F=8.17、P=0.002。5-FU組與對照組給藥結束后MVD、VEGF比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。免疫組織化學染色見圖1、2。

表2 17-DMAG組、5-FU組及對照組MVD、VEGF比較（ˉx±s）

圖1 17-DMAG組、5-FU組及對照組MVD免疫組織化學染色圖

圖2 17-DMAG組、5-FU組及對照組VEGF免疫組織化學染色圖

三、17-DMAG組、5-FU組及對照組蛋白印跡法檢測VEGF結果的比較

方差分析結果顯示，3組給藥結束后VEGF比較的F=14.52、P=0.001，17-DMAG組VEGF水平明顯低于5-FU組及對照組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 17-DMAG組、5-FU組及對照組蛋白印跡法檢測VEGF結果

討 論

腫瘤血管新生是實體瘤生長、浸潤和轉移非常關鍵的因素。新生血管除了為實體瘤提供新陳代謝的途徑外，還由于其管壁的高通透性，有利于腫瘤細胞的轉移[7］。與腫瘤血管新生密切相關的血管生成因子，如VEGF等，其水平升高在一定程度上反映了腫瘤血管的新生[8］。HSP90幾乎控制了所有惡性腫瘤細胞表型組成及細胞信號轉導通路，因此，HSP90抑制劑可能會影響腫瘤細胞中多條信號轉導通路，全面地影響腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移 等過程[9］。HSP90抑 制 劑17-AAG 和17-DMAG是苯醌類抗生素戈爾德霉素的衍生物。已有多個腫瘤臨床實驗證明17-AAG具有良好的治療效果[10］。但筆者見對水溶性和生物利用度更好的17-DMAG研究較少。本研究選擇人結腸癌SW620細胞株來構建腫瘤模型，采用新一代HSP90抑制劑17-DMAG對荷瘤裸鼠進行干預治療，探討其對結腸癌血管新生的抑制作用。

有研究認為采用免疫組織化學方法檢測CD31的表達，敏感性高、特異性較好，是目前測量腫瘤微血管密度最佳的方法之一[11］。本研究發現，17-DMAG組中MVD明顯低于5-FU組和對照組，而5-FU組與對照組之間MVD無明顯差異。5-FU雖然對腫瘤的質量、體積有一定的改善，但對腫瘤微血管生成抑制作用不明顯；而17-DMAG對腫瘤體積、抑瘤率和微血管新生均有明顯改善作用，提示17-DMAG對抑制腫瘤的生長、轉移和復發有著重要的作用。

VEGF是一種特異性高的血管內皮細胞刺激因子和血管通透劑，可促進不同來源的內皮細胞分裂增殖和血管構建，促使內皮細胞的遷移和血管內物質的滲漏，是腫瘤發生發展的重要標志[12］。因此筆者選擇VEGF為觀察療效的主要指標之一，本研究運用蛋白印跡法檢測到的結果顯示，17-DMAG組腫瘤組織中VEGF表達明顯低于5-FU組和對照組。故提示17-DMAG通過抑制結直腸癌細胞內VEGF表達，從而抑制腫瘤微血管生長，而5-FU并不能通過抑制VEGF阻止腫瘤微血管的生成。

綜上所述，17-DMAG能夠通過抑制腫瘤微血管生成和VEGF表達起抑制腫瘤的作用。但其作用機制可能還遠不止這些，需要不斷的研究探討。

[1]Koshiyama A，Ichibangase T，Imai K.Comprehensive fluorogenic derivatization-liquid chromatography/tandem mass spectrometry proteomic analysis of colorectal cancer cell to identify biomarker candidate.Biomed Chromatogr，2013，27：440-450.

[2]Shibuya M.Vascular endothelial growth factor and its receptor system：Physiological functions in angiogenesis and pathological roles in various diseases.J Biochem，2013，153：13-19.

[3]Aregbe AO，Sherer EA，Egorin MJ，et al.Population pharmacokinetic analysis of 17-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin（17-DMAG）in adult patients with solid tumors.Cancer Chemother Pharmacol，2012，70：201-205.

[4]Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al.Tumor angiogenesis：a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J Nail Cancer lnst，1992，84：1875-1887.

[5]Dias FJ，Issa JP，Barbosa AP，et al.Effects of low-level laser irradiation in ultrastructural morphology，and immunoexpression of VEGF and VEGFR-2 of rat masseter muscle.Micron，2012，43：237-244.

[6]Kong YC，Sun B，Zhao KX，et al.Small interference RNA targeting vascular endothelial growth factor gene effectively attenuates retinal neovascularization in mice model.Chin Med J，2013，126：1440-1444.

[7]Chien CC，Kempson IM，Wang CL，et al.Complete microscale profiling of tumor microangiogenesis：a microradiological methodology reveals fundamental aspects of tumor angiogenesis and yields an array of quantitative parameters for its characterization.Biotechnol Adv，2013，31：396-401.

[8]湯穎，葉增純，李燦明，等.VEGF對小鼠足細胞黏附性的影響及PI3 K/Akt信號通路在其中的作用.新醫學，2013，44：671-675.

[9]Franco MC，Ye Y，Refakis CA，et al.Nitration of Hsp90 induces cell death.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110：1102-1111.

[10]Saxena V，Naguib Y，Hussain MD.Folate receptor targeted 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin（17-AAG）loaded polymeric nanoparticles for breast cancer.Colloids Surf B Biointerfaces，2012，94：274-280.

[11]Ishizaka R，Hayashi Y，Iohara K，et al.Stimulation of angiogenesis，neurogenesis and regeneration by side population cells from dental pulp.Biomaterials，2013，34：1888-1897.

[12]Nonaka Y，Yoshida W，Abe K，et al.Affinity Improvement of a VEGF Aptamer by in Silico Maturation for a Sensitive VEGF-Detection System.Anal Chem，2013，85：1132-1137.