棉酚衍生物ApoG2誘導胃癌細胞凋亡及對Wnt6調(diào)控作用的研究

李天曉 元剛 葉麗君 孫健 黎曙霞

胃癌是世界范圍難治性腫瘤之一。誘導腫瘤細胞凋亡是研發(fā)抗癌藥的目標之一，棉酚衍生物ApoG2是針對細胞凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl2蛋白家族中抗凋亡蛋白結構開發(fā)出的新型棉酚衍生物，能夠拮抗Bcl2抗凋亡作用，釋放促凋亡蛋白Bax和Bak，啟動細胞凋亡程序[1］。目前ApoG2抗腫瘤能力已被廣泛證明，ApoG2不僅能影響B(tài)cl2家族的表達激活線粒體凋亡通路，也能通過誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡、細胞自噬等其他途徑引起腫瘤細胞死亡，提示ApoG2可能激活多條抑癌通路[2-4］。近來發(fā)現(xiàn)WNT信號通路在消化道系統(tǒng)腫瘤發(fā)生過程中扮演了重要角色。胃上皮組織Wnt/β-catenin通路的激活可直接引起腫瘤的形成[5］。Wnt6是WNT家族重要成員，參與調(diào)控細胞活動，包括細胞增殖、分化和遷移，在腫瘤細胞中高度表達，并且介導了胃癌細胞對化學治療的抵抗性[6-7］。WNT與Bcl2信號通路存在廣泛的相互作用[8-9］。有研究發(fā)現(xiàn)ApoG2能顯著下調(diào)WNT信號靶基因c-Myc和細胞周期蛋白cyclin D1的表達，但ApoG2對WNT蛋白家族的影響尚未見報道[10］。本研究以人胃腺癌細胞株BGC823為模型研究ApoG2誘導胃癌細胞凋亡的作用，并檢測ApoG2對Bcl2家族及Wnt6表達的影響，進一步探討ApoG2抗腫瘤機制和應用前景，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、細胞與試劑

人胃癌細胞株BGC823由中山大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室饋贈，培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基[含10%胎牛血清（Gibco，美國）、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco，美國）］，培養(yǎng)環(huán)境37℃，5% CO2。ApoG2由上海亞盛醫(yī)藥科技有限公司楊大俊教授饋贈，溶解于二甲亞砜（MP Biomedicals，美國）配成20 mmol/L儲存液，-20℃保存。

二、方 法

1.ApoG2對胃癌細胞BGC823生長抑制作用的檢測

采用噻唑藍（MTT）法。消化對數(shù)生長期的胃癌細胞BGC823，以培養(yǎng)液稀釋成終濃度為1×105/ml的單細胞懸液，每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，用不含血清的培養(yǎng)基梯度稀釋ApoG2母液至不同濃度（終濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μmol/L），加入培養(yǎng)孔中，每個濃度設3個復孔，對照組和調(diào)零組加入含0.1% 二甲亞砜培養(yǎng)基，其中調(diào)零組不接種細胞。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液（MP Biomedicals，美國）20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸棄孔內(nèi)溶液，加入二甲亞砜溶解結晶物，用酶標儀 （Thermo Multiskan GO，美國）檢測各孔在490 nm處的吸光度（OD），記錄OD值。細胞生長抑制率（%） = [1- （OD試驗組-OD調(diào)零組）/（OD對照組-OD調(diào)零組）]×100%。半數(shù)抑制濃度（IC50）指與對照組比較抑制50%細胞生長的藥物濃度。

2.藥物干預

根據(jù)MTT實驗的結果，ApoG2處理24、48、72 h均對細胞有較明顯的生長抑制作用，選取48 h作為藥物干預時間，選取給藥濃度中最接近48 h IC50值的1.25μmol/L，2倍的IC50值2.5μmol/L和4倍的IC50值5μmol/L作為藥物干預濃度。經(jīng)消化的細胞用完全培養(yǎng)基重懸稀釋接種于6孔板，細胞貼壁后分別用0.1% 二甲亞砜或1.25、2.5、5μmol/L ApoG2處理細胞48 h，進行后續(xù)實驗。

3.細胞凋亡形態(tài)的檢測

經(jīng)消化的細胞用完全培養(yǎng)基稀釋至105/ml接種于6孔板內(nèi)，每孔2 ml，培養(yǎng)過夜。按前述方法給藥48 h后，棄去培養(yǎng)基，按Hoechst33258染色試劑盒（碧云天，中國）說明書固定并染色。熒光顯微鏡（ZEISS Axio Imager Z1，德國）下觀察拍照。激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm。

4.細胞周期分析

將2×105/ml細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 ml，培養(yǎng)過夜。按前述方法給藥48 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞，加入預冷70%乙醇4℃固定過夜。棄固定液后用預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，用配好的DNA染色液[含0.2% Triton-X-100，RNase 100μg/ml，碘化丙啶（PI）50μg/ml］重懸細胞沉淀，37℃避光染色30 min，上流式細胞儀（Beckman Coulter FC500，美國）檢測細胞周期。分析Sub-G1期（凋亡導致基因組降解，其DNA含量少于G1期）細胞比例。

5.Bcl2家族基因表達水平的檢測

常規(guī)提取細胞總RNA，采用熒光定量逆轉錄PCR檢測，逆轉錄使用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒（Takara，日本），引物序列見表1。熒光定量PCR反應體系按照預混SYBR試劑盒（Takara，日本）說明書配制，按熒光定量PCR儀（ABI 7500，美國）說明設置反應程序。實驗所得數(shù)據(jù)按ΔΔCt法計算分析。

表1 引物序列

6.Wnt6蛋白表達水平的檢測

采用蛋白印跡法法檢測。BCA法檢測蛋白濃度后，用12% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，電轉至PVDF膜上，室溫封閉1 h，先后用Wnt6抗體（ab50030，Abcam）或GAPDH抗體（#2118，Cell Signaling Technology）、過氧化辣根偶聯(lián)的羊抗兔抗體（#7074，Cell Signaling Technology）孵育，于暗房內(nèi)等體積混勻增強型化學生物發(fā)光試劑盒（WBKLS0500，Millipore）工作液，滴于膜上目的蛋白條帶處，發(fā)光后曝光于X線膠片上。X線膠片在激光光密度圖像掃描儀（CanoScan LiDE 25）上掃描后用ImageJ1.44軟件計算條帶灰度值，以內(nèi)參GAPDH校正上樣量計算蛋白相對表達量。

三、統(tǒng)計學處理

每項實驗中，各濃度組均進行3次獨立重復實驗，采用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)。使用回歸分析擬合濃度-抑制率曲線計算IC50。計量資料以ˉx±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。多組比較以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，兩兩比較以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、ApoG2對BGC823細胞的生長抑制作用

MTT實驗結果顯示，各濃度ApoG2均能明顯抑制細胞生長，且隨著ApoG2干預濃度升高和干預時間延長，抑制作用更加明顯。給藥24、48、72 h的IC50分別為2.11、1.22、0.59μmol/L，見圖1。

圖1 不同濃度ApoG2對人胃癌細胞系BGC823的生長抑制作用

二、ApoG2誘導BGC823凋亡的檢測結果

1.形態(tài)學變化

ApoG2處理細胞48 h后，經(jīng)Hoechst33258染色后可見典型凋亡細胞，細胞呈高亮藍色，核固縮或呈分葉狀，而對照組細胞呈淡藍色。隨ApoG2給藥濃度升高，細胞數(shù)目逐漸減少，高亮細胞比例逐漸升高，見圖2。

圖2 不同濃度ApoG2作用下BGC823細胞的凋亡情況（Hoechst染色，×40）

2.細胞周期變化

與對照組相比，ApoG2處理細胞48 h后Sub-G1期細胞數(shù)目明顯增多，1.25、2.5、5μmol/LApoG2處理細胞48 h后Sub-G1期細胞比例分別為（27.6±3.2）% 、（33.4±2.1）% 、（54.3±2.8）%，對照組Sub-G1期細胞比例為 （6.4±1.3）%，4組Sub-G1期細胞比例比較差異有統(tǒng)計學意義（F=192.6，P＜0.001），各給藥組Sub-G1期細胞比例均比對照組明顯增高（t分別為10.631、18.935、26.875，P 均 ＜0.001），且ApoG2 5μmol/L組中Sub-G1期細胞比例高于ApoG2 1.25μmol/L組及2.5μmol/L組，見圖3。

三、ApoG2對BGC823細胞Bcl2家族基因表達的影響

BGC823細胞與0.1% 二甲亞砜、1.25、2.5、5μmol/L ApoG2分別孵育48 h后，1.25、2.5、5 μmol/L組Bcl2 mRNA表達水平分別比對照組下調(diào)至0.81、0.67、0.42倍（t=11.162，P＜0.01）。2.5、5μmol/L組Bax mRNA表達水平分別比對照組上調(diào)至1.95倍（t=16.454，P＜0.01）、6.24倍（t=90.76，P＜0.001），Bak mRNA表達水平則分別上 調(diào) 至 2.11、6.23 倍（t分 別 為 19.226、11.323，P均＜0.01）；1.25μmol/L組Bax、Bak mRNA表達水平分別為對照組的0.91、0.96倍，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見圖4。

圖3 不同濃度ApoG2作用下BGC823細胞周期檢測結果

圖4 不同濃度ApoG2作用下BGC823細胞Bcl2家族基因表達水平的比較

四、ApoG2對BGC823細胞Wnt6蛋白表達水平的影響

BGC823細胞與0.1%二甲亞砜、1.25和2.5 μmol/LApoG2分別孵育48 h后，1.25和2.5μmol/L組Wnt6蛋白表達水平分別比對照組下調(diào)至0.76、0.71倍（t分別為19.226、11.323，P均＜0.01），見圖5。提取細胞總蛋白后，5μmol/L組在最大上樣體積內(nèi)無法滿足最低上樣蛋白量，降低蛋白量則影響對Wnt6表達的檢測，故未檢測5 μmol/L組ApoG2處理后細胞Wnt6蛋白的表達量。

圖5 不同濃度ApoG2作用下BGC823細胞中Wnt6蛋白表達水平的比較

討 論

我國胃癌發(fā)生率及病死率均較高，外科手術是治療胃癌最有效的手段，然而多數(shù)胃癌發(fā)現(xiàn)時已錯過了最佳手術時期，對于不能手術、術后復發(fā)或遠處轉移的胃癌，化學治療是主要的治療手段。胃癌對傳統(tǒng)的化學治療方法存在嚴重的耐藥現(xiàn)象，因此尋找安全、有效的抗腫瘤藥物是胃癌研究領域的重要任務。Bcl2蛋白家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤耐藥性的產(chǎn)生密切相關[11］。多種惡性腫瘤中可見Bcl2過度表達，在胃癌組織中Bcl2過度表達率高達60%～70%[12-13］。因此抑制腫瘤細胞過度表達Bcl2的抗凋亡作用可作為治療胃癌的新策略。

ApoG2是具有Bcl2蛋白家族抗凋亡蛋白泛抑制作用的新型棉酚衍生物，與母體化合物相比具有更強的抗腫瘤作用和較小的毒性作用[14］。已有研究顯示ApoG2可在體外誘導包括胃癌細胞系MKN28、MKN45和AGS凋亡[15］。胃癌動物試驗也證實了ApoG2的體內(nèi)抗腫瘤能力[3］。ApoG2可能成為治療胃癌的新型藥物之一，具有進一步研究的價值。本研究以取自中國患者胃癌組織建立的BGC823細胞株為模型，證實了ApoG2能夠以低濃度抑制BGC823細胞生長，誘導細胞凋亡。據(jù)報道，Wnt6在胃癌細胞中高度表達，且表達量與胃癌細胞對化學治療的耐藥對象呈正相關，敲除Wnt6基因可明顯提高胃癌細胞對化學治療的敏感性[2］。在經(jīng)典的WNT信號通路中，WNT信號可通過β-鏈蛋白調(diào)控核內(nèi)基因轉錄，也有研究表明在結腸癌細胞中WNT信號可激活Bcl2抗凋亡蛋白Bcl-w啟動子促進Bcl-w的表達抵抗細胞凋亡[16］。因此，研究進一步檢測了ApoG2對Wnt6及Bcl2家族的影響。結果發(fā)現(xiàn)，ApoG2能夠下調(diào)Wnt6蛋白的表達，同時下調(diào)抗凋亡標志Bcl2基因的表達水平，并上調(diào)促凋亡標志Bax和Bak的表達水平。本研究結果提示，ApoG2可能通過下調(diào)Wnt6的蛋白水平影響B(tài)cl2、Bax和Bak的基因轉錄，引起細胞凋亡。由于Wnt6與胃癌耐藥性密切相關，對于Wnt6高表達的耐藥性胃癌，ApoG2有可能成為其中一種新型治療藥物。

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