SD大鼠大椎穴BDA神經通路示蹤研究

云南中醫學院，云南 昆明 650500

SD大鼠大椎穴BDA神經通路示蹤研究

和鳳軍唐柱生吳冠儒陳學秋李啟勇宋波郝敬紅黃利民

云南中醫學院，云南 昆明 650500

目的探討大椎穴神經傳導通路及其與周圍非穴位區神經通路有無差異，為針刺大椎穴治療疾病機理與神經調節的相關性提供形態學依據。方法將12只SD大鼠分成實驗組和對照組，每組6只。大椎穴組(實驗組)和第6～7頸椎棘突間組(對照組)分別于大椎穴和第6、7頸椎棘突之間注射15%BDA，10μl/只，所有實驗大鼠注射后存活7天，行灌注固定取腦和脊髓，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖-0.1M PBS液沉底，取脊髓C1-C4和腦干行片厚10μm冰凍切片，免疫組化反應，DAB顯色，觀察各組腦干和脊髓內陽性細胞的分布特點和差異。結果BDA陽性細胞呈棕黃色，胞核淡染，胞質和突起染色深。在脊髓C1-C4節段灰質前角、后角、灰質聯合、網狀結構均可見到數量不等、大小不一的陽性細胞，其中實驗組各部的陽性細胞均多于對照組，組間比較差異明顯有統計學意義；中腦內紅核和中央尾葉核均可見陽性細胞，其中實驗組陽性細胞明顯多于對照組，差異有統計學意義。結論BDA可以跨神經元逆行轉運，是穴位神經通路示蹤的可靠神經示蹤劑；大椎穴及其周圍非穴位區神經通路在脊髓上頸節段和中腦傳導路徑相似，但是各部的陽性細胞數量有差異，實驗組陽性細胞明顯多于對照組，其機理和詳細神經通路有待進一步深入研究。

SD大鼠；大椎穴；神經通路示蹤；BDA

大椎穴是中醫臨床常用的穴位,可用于治療感冒、哮喘、發熱、失眠、椎-基底動脈供血不足、頸椎病、痤瘡、帶狀皰疹、白細胞減少癥、急性扁桃體炎、咽炎、糖尿病性周圍神經病變、高血壓等[1]，是治療疾病、保健養生的要穴。但是，針刺或艾灸大椎穴治療以上疾病的具體機理還不完全清楚。目前普遍認為神經系統-免疫系統-內分泌系統之間存在相互調節，相互影響，共同構成人體調節網絡。本研究通過用生物素葡聚糖胺(Biotinylated-dextran amine，BDA)對SD大鼠大椎穴神經通路進行示蹤，以期探討該穴位區與中樞神經之間的神經通路聯系，這將有助于從神經調節角度探討針刺或艾灸大椎穴治療疾病的機理，為闡明針刺大椎穴治療疾病的相關機理提供形態學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 SD大鼠12只 雌雄各6只，四川省醫學科學院實驗動物研究所，許可證號(合格證號)SCKK(川)2004-16，SCXK(川)2005-00010Q。分為大椎穴組(實驗組)和第6～7頸椎棘突間組(對照組)兩組，每組各6只。

1.2 注射方法 按林文注[2]大鼠大椎穴“在第7頸椎與第1胸椎間，背部正中”定位，25%烏拉坦按0.3ml/100g體重腹腔注射麻醉，以隆椎為體表標志，剪去項背部正中皮毛，定位清楚后實驗組在大椎穴注射15%BDA，10μl/只，與棘突間平行進針，深度約5mm，注射完后留針10min；對照組于項部正中，第6～7頸椎棘突間注射15%BDA，10μl/只，與棘突間平行進針，深度約5mm，注射完后留針10min。兩組實驗大鼠注射神經示蹤劑后籠養存活7天。

1.3 試劑及儀器 神經示蹤劑Neuro Trace TM BDA-10,000 Neuronal Tracer Kit，U.S.A. 含：①10，000Mw BDA(A劑)，凍干BDA 3mg/瓶×6瓶，②avidin-HRP(B劑)，凍干avidin-HRP 100μg/瓶×6瓶，③DAB(C劑)，250mg/瓶×1瓶。于-200C～-800C冰箱干燥避光保存，購自北京中杉金橋；DAB顯色試劑盒(20×)3ml,ABC各3ml，A濃縮緩沖液，B濃縮DAB溶液，C濃縮過氧化氫溶液；烏拉坦(氨基甲酸乙酯，國藥集團化學試劑有限公司生產)；PBS磷酸鹽緩沖液ZLI-9062 2000ml/袋(0.01M PH 7.2～7.4)，北京中杉金橋生物技術有限公司生產；France Millipore 超純水系統；Leica CM 1900冰凍切片機；Motic BA310-Moticam Pro282A病理圖像分析系統。

1.4 灌注取材 大鼠稱重，按25%烏拉坦0.3ml/100g體重腹腔注射麻醉，仰臥位將大鼠四肢和頭部固定在自制大鼠固定板上，從上腹部剪開皮膚至頸部，向兩側分離皮膚暴露胸部肌肉，從劍突兩側依次向嘴側剪開膈、肋和肋間肌，向嘴側翻起胸骨及其連帶組織，充分暴露胸腺、心包和肺。將輸液針從心尖刺入插至升主動脈，先灌注生理鹽水約130ml，剪開右心房排血至流出清亮液體，再灌注4%多聚甲醛約250ml至大鼠四肢和尾巴堅硬為止。將固定好的大鼠取俯臥位固定，從后正中線由尾側向嘴側剪開皮膚并向兩側分離，從棘突兩側切開分離肌肉充分暴露脊柱棘突、肋、枕骨、顱頂骨，從第四腰椎棘突平面始，用小止血鉗咬開棘突、椎板暴露椎管和馬尾，用細頭止血鉗輕輕插入椎管由橫突水平從尾側到頭側方向夾除椎弓板及橫突顯露脊髓，在頭部正中用手術刀背沿正中線劃數下，用剪子輕鉆一個小洞，從小洞用止血鉗向兩側撐開顱骨暴露腦，用止血鉗夾除延髓和脊髓交界處枕骨充分暴露腦和脊髓，從尾側提起脊髓，剪除兩側前后根絲等脊髓與椎管間的連結組織、剪除與腦相連的腦神經根，將腦和脊髓一起取出置入4%多聚甲醛中存儲。

1.5 切片及染色 取腦干和上頸段C1-C4脊髓30%蔗糖沉底，行片厚10μm冰凍切片。0.01MPBS液漂洗切片3次，10min/次→切片入1.0μg/ml Avidin-HRP液中，40C冰箱濕盒過夜→PBS液漂洗切片3次，10min/次→0.003%DAB顯色時間3～5 min，有反應后用蒸餾水終止DAB顯色→梯度上行酒精脫水(70%Alc→80%Alc→90%Alc→95%Alc→100%AlcⅠ→100%AlcⅡ，5～10min/次)→二甲苯透明(二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，5～10min/次)→中性樹膠封片。

1.6 觀察分析 在顯微鏡下，觀察腦干和脊髓上頸段切片中陽性細胞和陽性纖維的分布情況。Motic 病理圖像分析系統下拍片。兩組大鼠腦干和脊髓上頸段切片分別各取40片，在×200倍顯微鏡下計數陽性細胞。

2 結果

BDA陽性細胞呈棕黃色，胞核淡染，胞質和突起染色深。在兩組大鼠脊髓C1-C4節段灰質前角、后角、灰質連合、網狀結構均可見到數量不等、大小不一的陽性細胞(見圖①-⑧)，其中實驗組各部的陽性細胞均多于對照組，組間比較差異明顯有統計學意義(具體見表1)。

灰質前角(個)灰質后角(個)灰質連合(個)網狀結構(個)實驗組35±6 60☆28 1±1 87☆17 4±2 03☆16 8±2 30☆對照組29 6±1 2718 6±2 8813 4±1 5812 9±0 99

注：與對照組比較，☆P<0.05。

脊髓前角可見大、中、小陽性細胞，大細胞多見于前角尖，后角可見少量小陽性細胞，背外側索見密集纖維。中央管前后灰質連合見大量中、小陽性細胞，網狀結構見中多個小細胞，胞核淡染，細胞呈梭形或多角形，可見明顯的突起。

中腦內紅核和中央尾葉核均可見陽性細胞(見圖a-d)，其中實驗組陽性細胞明顯多于對照組，差異有統計學意義。

3 討論

BDA是一種與生物素結合的多聚葡萄糖胺，可用于順行和逆行示蹤，由Glover等[3]于1986年首次成功地運用在神經束路追蹤中。陳亞亮[4]等應用BDA法成功地顯示了大鼠脊髓小腦束、前庭束纖維在小腦中央核及前庭核中的投射。

本次實驗采用BDA進行大椎穴及其周圍非穴位區神經通路示蹤，兩組均于脊髓和腦干清楚顯示了BDA陽性細胞，提示BDA是穴位神經通路示蹤的可靠示蹤劑，可以逆行跨神經元示蹤；且實驗組的陽性細胞明顯多于對照組，可能與大椎穴處感受器、運動神經末梢比非穴位區密集有關，提示大椎穴治療疾病與神經調節有一定的相關性。鑒于本次研究資料有限，大椎穴與延髓、腦橋、脊神經節、頸交感神經節、小腦、下丘腦等的神經通路聯系還有待進一步研究。大椎穴左、右旁開處、第7頸椎與第1胸椎棘突間與大椎穴神經通路有無差異還需要進一步探討。相信隨著研究的深入，項目組可以闡明大椎穴與中樞神經聯系的神經通路，為大椎穴治療疾病與神經調節相關性提供形態學依據。

[1]翟景慧,李曉泓,李輝,等.近年大椎穴臨床研究概況. 北京中醫,2004, 23(3):186-188.

[2]林文注，王佩.實驗針灸學.上海科學技術出版社,1999，9：288.

[3]Glover J C, Petursdottir G, Jansen J K S. Fluorescent dextran-amines as neuronal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J Neurosci Method, 1986,18:243～254.

[4]陳亞亮,李 莉,高秀來. BDA法神經束路追蹤技術. 首都醫科大學學報,2002,23(3):258-260.

云南省教育廳科學研究基金項目(立項)資助，項目編號：06Y318C。

和鳳軍(1970-)，男，納西族，醫學碩士，副教授，主要從事解剖、組胚學教學與科研。

R33-33

A

1007-8517(2014)13-0038-02

2014.05.08)