生長因子對活髓治療修復作用的研究進展

梁介技 楊媛文 黎淑芳

隨著生物活性材料的不斷發展，診療技術以及微創理念的不斷提高，活髓保存治療在臨床工作中較常見，活髓治療后的牙髓組織能自我修復，其中需要修復相關的生長因子及蛋白參與。本研究就活髓保存治療中修復相關生長因子及蛋白對牙髓損傷修復的作用作一綜述。

牙髓損傷常因齲源性、機械性及外傷等導致，牙髓損傷后常使用優良的蓋髓材料在近髓處或牙髓暴露表面覆蓋并嚴密充填，降低牙髓的炎癥反應及防止牙髓炎惡化，從而激發牙髓的反應性修復，即為活髓保存治療。活髓保存治療時，需減少外界環境對牙髓的刺激，牙髓損傷后可自身修復，修復時，許多細胞因子和蛋白在牙髓組織中表達并發揮重要的生理功能。研究表明，含有骨形態發生蛋白-2（Bone morphogenetie pro-tein-2，BMP-2）的明膠海綿在蓋髓時能誘導修復性牙本質的形成，且在減少炎癥反應方面展示出優異性能[1]；牙本質基質蛋白-1（Dentin matrix protein-1，DMP-1）在牙髓中過表達能誘導未分化間充質干細胞分化以及形成成牙本質細胞樣細胞[2]；轉化生長因子-β（TGF-β）能刺激牙髓-牙本質復合體細胞并介導牙髓修復過程[3]；牙本質涎蛋白（Dentin sialoprotein，DSP）在蓋髓治療時能誘導牙髓間充質細胞的增殖、分化、遷移，刺激牙髓血管化并參與牙本質的形成和礦化[4]；在蓋髓術中牙本質磷蛋白（Dental phosphoprotein，DPP）能減少牙髓的炎癥反應及促進修復性牙本質的形成[5]。以下介紹5 種與牙髓自我修復相關的生長因子及蛋白。

1 BMP-2

BMP 是TGF-β 超家族中重要的信號因子，不僅在牙齒發育中起著至關重要的作用，參與牙齒形成和組織修復，同時BMP 信號在分化成牙本質細胞的功能中也起重要作用，其作用是沉積和礦化牙本質基質[1]。BMP-2 在介導人牙髓干細胞（hDPSCs）增殖分化過程中，ERK/Smad 通路起到激活活化作用[6]。Parsegian[7]研究發現，原代牙髓（DP）在成牙本質細胞和成骨細胞分化過程中，BMP-2 和成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）對成牙本質細胞分化具有相互刺激的關系，而它們對成骨細胞分化的作用是獨立介導的。其他學者也證實，iRoot BP Plus、BMP-2 都能提高人牙髓細胞（hDPCs）的增殖及成牙本質化的能力，然而，與單獨使用iRoot BP Plus 或BMP-2 對比，iRoot BP Plus 與BMP-2 聯合使用在誘導hDPCs 增殖、成牙本質分化方面更加高效[8]。在活髓保存的研究中，國內學者使用含有Nel-like molecule-1（NELL-1）和BMP-2 明膠海綿對大鼠上頜第一磨牙進行牙髓覆蓋后，發現聯合使用NELL-1和BMP-2 在誘導修復性牙本質形成和減少炎性細胞反應等方面顯示出優異性能，而且聯合使用可以顯著調節牙髓修復[9]。同時，Souza 等[10]使用兩種修復性生物材料蓋髓并研究BMP-2 對牙髓礦化的作用時，qPCR 結果顯示，與對照組及礦物三氧化物凝聚體（MTA）組相比，Biodentine（BD）組在30 天和60天時BMP-2 的表達顯著增加，BMP-2 與礦化牙本質組織的形成有密切關系，因此BD 可以應用于牙髓手術中。另一位學者也證實，BMP-2 和TGF-β1 溶液分別與iRoot BP Plus 混合調勻用于蓋髓術后能促進修復性牙本質的形成[11]。在進行活髓保存治療時，BMP-2 對牙髓組織修復具有重要意義，同時，BMP-2與其他生物材料結合也能取得很好的效果，因此，可選擇BMP-2 作為牙髓修復的參考因子。

2 DMP-1

DMP-1 是一種高度磷酸化的酸性非膠原蛋白，其在羥基磷灰石晶體生成以及礦化中起到調節作用。DMP-1 在牙髓多功能干細胞和未分化間充質干細胞中的過表達可以誘導這些細胞分化并形成功能性成牙本質細胞樣細胞[2]。在牙齒發育的幾個階段中，DMP-1 作為細胞內及細胞外的信號分子介導成牙本質細胞的分化，研究發現DMP-1 缺失的小鼠可導致牙齒礦化不足[12]。在凋亡的環境中DMP-1 對成牙本質細胞和成釉細胞具有保護作用[13]。DMP-1介導細胞分化及礦化的通路中，其是通過激活絲裂原活化蛋白激酶-細胞外調節蛋白激酶（MAPKERK）通路激活干細胞的增殖分化，并且對成牙本質細胞及成骨細胞礦化具有促進作用[14]。研究發現，牙髓損傷修復過程中，DMP-1 沿著原發性牙本質和新形成的牙本質之間的邊界沉積，其表達先于巢蛋白免疫反應細胞，并激活細胞的增殖及新基質的形成，表明DMP-1 是牙髓修復的觸發因素[15]。Yamada 等[16]使用氫氧化鈣（CH）、MTA、MTA 和富血小板血漿（MTA+PRP）對大鼠上頜第一磨牙進行直接蓋髓，組織學上發現用MTA 和MTA+PRP 填充7 天和14 天后，觀察到在嗜酸性牙本質橋（DB）或類骨牙本質（OD）中DMP-1 呈陽性，并且DMP-1陽性顆粒基質最終沉積在DB 和OD 的牙本質管中，這些發現表明MTA 和MTA+PRP 可能通過相關生長因子誘導未分化間充質細胞向成牙本質細胞分化。同時，有學者使用不同蓋髓材料對人乳牙進行活髓切斷術后，研究DMP-1 的免疫定位時發現MTA 組和硅酸鹽水泥（PC）組中存在牙髓修復，沒有炎癥，并且形成硬組織屏障，免疫組化發現MTA 組與PC 組中DMP-1 在根部的牙本質以及在新形成的硬組織屏障小管中有相似表達[17]，說明DMP-1 參與了牙髓修復過程。在活髓保存時良好的蓋髓劑蓋髓并嚴密充填后，在良好的封閉環境中，DMP-1 可在牙髓覆蓋部位和牙髓組織中作為修復相關的信號因子，誘導牙髓干細胞分化以及修復性牙本質的形成，同時，被誘導分化后的細胞具有再生牙本質樣組織的潛力，也可能形成功能、結構、生理上與牙本質類似的組織，因此DMP-1 可以作為修復相關的因子參與牙髓損傷修復過程。

3 TGF-β

TGF-β 有3 種相似的亞型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3），調節相關細胞的增殖、分化、趨化和凋亡[18]。TGF-β 超家族生長因子具有廣泛的生物活性，在牙齒及顱面骨的發育、形成和疾病中具有重要意義，其中TGF-β1 參與成牙本質細胞分化以及牙本質的礦化[19]。TGF-β 超家族信號傳導中有兩個分支，其中TGF-β 分支，如TGF-βs 主要磷酸化和激活Smad2 和Smad3，而另一個分支BMP 分支，其主要激活Smad1、Smad5 和Smad8[20]。Li 等[21]研發一種能持續釋放TGF-β1 微球的殼聚糖雙層膜材料，并用于犬齒的蓋髓術中，60 天后發現未蓋髓組中未形成修復性牙本質橋，不含TGF 殼聚糖雙層膜組及Dycal 組形成不規則的修復性牙本質，而含有轉化生長因子-β1（MS-TGF）微球殼聚糖雙層膜組形成具有牙本質小管的實質性修復性牙本質，其厚度為（142±29）μm，是不含TGF 殼聚糖雙層膜組及Dycal 組厚度的3～6 倍。國外學者使用自體牙髓干細胞（DPSCs）和MTA 對暴露犬牙進行蓋髓的研究中，發現MTA 能誘導牙髓蓋髓處形成了一個幾乎完整的鈣化橋，DPSCs 組中6 周時受損牙髓能修復再生，伴有礦化及鈣化物的沉積，12 周時礦化的牙本質周圍排列著一層清晰的成牙本質細胞并突向小管以及正常的牙髓組織中，并且DPSCs 組中TGF-β1 的表達明顯強于MTA 組，說明DPSCs 在牙本質的修復和再生過程中具有更大的能力。這些研究表明，TGF-β1 在刺激牙髓-牙本質復合體細胞和介導牙髓修復過程中發揮重要作用[3]。另一項研究中，在大鼠上頜第一磨牙牙髓暴露后并用氫氧化鈣（CH）和MTA 進行蓋髓，另一組未進行任何處理，與未處理的對照組比較，發現CH 和MTA組下調了腫瘤壞死因子-α 表達，上調了TGF-β的表達[22]。牙髓損傷修復的過程中機制復雜，存在許多因子以及相關信號通路的參與，研究發現，TGF-β1 可以通過激活蛋白激酶B（AKT）、細胞外信號調節激酶1/2（Erk1/2）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38）MAPK 信號通路，促進牙髓干細胞在早期向成牙本質細胞分化[23]。在齲齒以及因其他原因引起的牙髓損傷中，TGF-β1 作為一種重要的生長因子參與并影響成牙本質細胞分化和鈣化物沉積的自我修復過程，因此我們在研究中可以選擇TGF-β1 作為活髓治療后牙髓損傷修復過程中鈣化物形成的指標之一。

4 DSP

牙本質發育與形成過程中，成牙本質細胞分泌并合成相關的非膠原蛋白進入牙本質細胞外基質中，DSP 和牙本質磷蛋白（DPP）是主要的兩種牙本質非膠原細胞外基質，來源于牙本質涎磷蛋白（DSPP）。DSP 可以通過調節靶基因表達，參與細胞增殖分化以及牙本質的形成和礦化，在蓋髓治療時，DSP 誘導牙髓間充質細胞的分化、遷移并刺激牙髓血管化，說明DSP 具有作為牙髓-牙本質復合體再生劑的潛力[4]。制備窩洞或牙髓暴露等因素引起的牙髓損傷后，新分化形成的或者原存留的成牙本質細胞樣細胞表達DSP 并參與修復性牙本質的免疫反應，同時在小鼠的免疫組織化學及原位雜交研究中發現，DSP 蛋白及mRNA 水平表達增加與成牙本質細胞分化的過程相一致[24]。與DSP 相關的蓋髓研究中，張瑩等[25]使用人牙本質涎蛋白（hDSP）對狗牙進行蓋髓，結果發現術后8 周hDSP 組完整的骨樣牙本質橋下方成牙本質細胞樣細胞排列整齊，因此，hDSP 可以誘導牙髓細胞的分化以及修復性牙本質的形成。Fransson 等[26]研究發現EMDgel蓋髓處有增生的牙髓附著，同時EMDgel 或氫氧化鈣蓋髓后新形成的硬組織中含有DSP 和膠原蛋白I（Col I）表達，可以認為DSP 和Col I 是牙本質形成的標志物。同時，國內學者用含有Matrilin-4 的膠原蛋白海綿進行蓋髓研究，發現在第7 天時可見穿髓孔下有前期牙本質的形成，28 天時可見厚而完整的修復性牙本質形成，而且新形成的修復性牙本質下可見重組的成牙本質細胞層，免疫組化中DSP 在3～14 天時表達逐漸增強，28 天時表達減弱[27]。DSP參與牙髓損傷修復的過程以及機制尤為復雜，過程中存在信號通路的傳導以及信號因子的表達，DSP作為一種配體，通過其細胞膜受體、整合素β6 和Ocln 促進細胞內信號傳導，并誘導牙髓間充質干細胞分化和礦化[28]。

5 DPP

DPP 是DSPP 的另一個產物，由于其氨基酸結構中存在大量的天冬氨酸和磷酸絲氨酸，說明其帶有酸性和陰離子性，能與Ca2+結合，因此DPP 能促進和調節羥基磷灰石晶體形成和沉積[29]。國外學者研究人DPP 衍生的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽對hDPSCs 增殖、分化和礦化的影響，結果發現3 種RGD 均能促進hDPSCs 的增殖，與RGD-1、RGD-2 組相比，RGD-3 能顯著提高堿性磷酸酶（ALP）的活性，并且DMP-1、DSPP、ALP、骨涎蛋白（BSP）的mRNA 表達更顯著，總之，人DPP 衍生的RGD 肽RGD-1、RGD-2 和RGD-3 在體外促進hDPSCs 的增殖、分化和礦化。在這3 種肽中，RGD-3 的作用最為顯著。RGD-3 與hDPSCs 表面的整合素受體結合，并通過激活MAPK 通路的p38調節成牙基因的表達和分化[30]。在蓋髓術中，有學者使用DPP 對小型豬恒牙進行蓋髓，結果顯示，2 周后牙髓細胞在形成的修復性牙本質周圍發育成成牙本質細胞，1 個月后修復性牙本質橋完成，3 個月后牙本質橋變得致密而厚實，且主要為管狀牙本質，這項研究表明DPP 不僅對牙髓刺激小，而且能誘導牙髓細胞向成牙本質細胞發育并形成牙本質橋[31]。使用含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序的DPP 肽和CH 對大鼠進行蓋髓后，組織學上發現在第4 周時，與CH 組形成的有孔隙和粗糙的修復牙本質相比，RGD 組則誘導形成密集而致密的修復性牙本質，且形成率高于CH 組，牙髓的炎癥狀態也低于CH 組[32]。同時另有研究也證實，中等劑量的磷酸磷蛋白（PP）和重組DSP/磷酸磷脂（也稱重組牙本質涎磷蛋白，recDSP/PP）蓋髓后能減輕牙髓炎癥，并促進修復性牙本質的形成[5]。然而，DPP 在牙髓干細胞分化以及牙髓組織修復過程中也有信號因子以及相關通路的傳導，有學者研究發現DPP 激活NF-κB 后，啟動信號級聯反應，從而促進DPSCs 的牙源性分化[33]。

6 總結與展望

活髓保存治療的成功需要及時控制感染的牙髓以及阻斷牙髓炎癥的惡化，采用生物材料保護牙髓，刺激牙髓進行自我修復，并嚴密充填形成良好的密閉環境。活髓保存的生物學基礎是牙髓中有自我更新及具有分化能力的干細胞，當牙髓受到外部因素刺激時，這些細胞可能分化為成牙本質細胞樣細胞參與牙髓損傷的修復過程。牙髓損傷修復是個生理機制尤為復雜的過程，在這個過程中存在多種機制的參與，許多生長因子及蛋白的表達，如上述的BMP-2、DMP-1、TGF-β、DSP、DPP 等在牙髓損傷修復過程中至關重要。雖然國內外學者對牙髓損傷修復進行了相關研究并有了一定的進展，但是相關的作用機制并不十分清晰，今后還需要進一步的研究和討論。