干旱脅迫下甘肅野生草地早熟禾內(nèi)源激素水平的動態(tài)變化

俞 玲,馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

當(dāng)今世界，水資源的匱乏是一個普遍性的問題，尤其在西北地區(qū)顯得更加突出。干旱脅迫是限制草坪草生長的最重要的環(huán)境因子之一[1]，不僅威脅其幼苗的生存,且對后期產(chǎn)量、越冬等都有一定影響[2,3]。因此,研究其抗旱性,對北方地區(qū)草坪的建植、植被恢復(fù)以及生態(tài)環(huán)境改善具有重要意義。

內(nèi)源激素是植物體內(nèi)重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì),與植物抗逆性有著密切的聯(lián)系。逆境條件打破了植物體內(nèi)激素產(chǎn)生和分配的平衡狀況,導(dǎo)致代謝途徑發(fā)生變化,使植物對逆境的適應(yīng)性與抗性增強(qiáng)[4],很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，氣孔是對植物激素變化最敏感的部位，并且認(rèn)為脫落酸(ABA)[5]和細(xì)胞激動素(CTK)[6]的相互作用對氣孔開閉產(chǎn)生影響進(jìn)而增加其對干旱的適應(yīng)性。Lu等[7]研究證明在干旱脅迫下,小麥葉片中ABA含量升高,并且抗旱品種積累的ABA較多。目前,對優(yōu)良抗旱草坪草草地早熟禾的選育成為研究熱點(diǎn)，有關(guān)干旱脅迫下草地早熟禾生理指標(biāo)的變化報道的很多[8-10]，而對草地早熟禾內(nèi)源激素的動態(tài)變化研究還較少。因此，以甘肅省野生草地早熟禾為材料，采用高效液相色譜法，就不同草地早熟禾材料在干旱脅迫下ABA，IAA和ZT 3種內(nèi)源激素的動態(tài)變化進(jìn)行分析，探討草地早熟禾對干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制，以期為草地早熟禾抗旱性的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料和試驗(yàn)儀器

安定(AD)和西和(XH)野生草地早熟禾種子分別采自甘肅省定西市安定區(qū)、隴南市西和縣。

試驗(yàn)采用Agilent 1100 Series液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、VWD檢測器、紫外分光光度計(jì)、0.22 μm有機(jī)系針頭過濾器。ZT標(biāo)樣購自蘭州中瑞實(shí)驗(yàn)耗材經(jīng)營部國產(chǎn)分裝產(chǎn)品；IAA和ABA標(biāo)樣購自蘭州科邁實(shí)驗(yàn)耗材經(jīng)營部國產(chǎn)分裝產(chǎn)品；甲醇、石油醚為色譜純；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院培養(yǎng)室進(jìn)行，2013年4月5日將野生草地早熟禾成熟種子播于直徑18 cm的花盆，種植基質(zhì)為土壤、有機(jī)質(zhì)、砂子按7∶2∶1組成。試驗(yàn)設(shè)置對照(CK)和成坪以后進(jìn)行的干旱處理，即草地早熟禾充分灌水(即達(dá)到土壤最大持水量)后不再澆水，令其自然失水，干旱處理以土壤含水量占最大持水量的百分比分為5個梯度：無脅迫(CK，100%)，輕度脅迫(75%～85%)，中度脅迫(55%～65%)，重度脅迫(35%～45%)，嚴(yán)重脅迫(15%～25%)，每份材料3個重復(fù)，當(dāng)土壤含水量在設(shè)定的梯度范圍時，采取葉片進(jìn)行測量，每天早上8∶30補(bǔ)充前一天失去的水分，使各處理在采樣時達(dá)到設(shè)定的含水量。

1.2.2 樣品處理及HPLC分析 稱取新鮮葉片1 g，加入10 mL預(yù)冷的80%甲醇，液氮研磨至勻漿。密封置冰箱4 ℃，浸提24 h，5 000 r/min離心15 min，取上清液，殘?jiān)偌尤? mL 80%的冷甲醇溶液避光數(shù)小時，相同條件離心10 min，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀35 ℃蒸至原體積的1/2。經(jīng)C18膠柱分離純化后，氮?dú)獯蹈桑鲃酉喽ㄈ葜? mL，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系針頭過濾，取20 μL進(jìn)行色譜分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：采用Eclipse XDB-C8柱(4.6 mm×150 mm,5 um)；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流動相按甲醇∶0.6%冰乙酸(45∶55)為基準(zhǔn)前后變化進(jìn)行摸索，柱溫設(shè)置25 ℃和35 ℃兩個溫度，進(jìn)行比較。最后以激素徹底分離，峰形好來選擇出最佳的流動相和柱溫。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，Spass 19.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇 采用甲醇和水作為流動相時，3種激素分離不完全，且色譜圖拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，峰形不好。冰乙酸可以抑制樣品的電離、改善拖尾現(xiàn)象，因此，在流動相中加入0.6%冰乙酸。試驗(yàn)就流動相中甲醇和冰乙酸的體積比進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明，當(dāng)甲醇與0.6%冰乙酸體積比>45∶55時，各激素能完全分開，但色譜峰分離度較小；當(dāng)體積比<45∶55時，激素靈敏度下降、保留時間迅速增加，且易對色譜柱的填充物造成損害；當(dāng)體積比為45∶55時，各個激素分離徹底、峰形好，無拖尾現(xiàn)象。故選擇甲醇∶0.6%的冰乙酸為45∶55的流動相。

2.1.2 柱溫的選擇 柱溫對不同激素色譜峰之間的分離有顯著的影響。因此,設(shè)定25 ℃和35 ℃ 2個梯度，對不同柱溫下IAA，ZT和ABA之間的分離效果進(jìn)行了研究，試驗(yàn)表明在25 ℃柱溫下分離效果最佳。

2.2 干旱脅迫下野生草地早熟禾葉片內(nèi)源激素的動態(tài)變化

2.2.1 干旱脅迫下草地早熟禾葉片ZT含量變化 干旱脅迫促使草地早熟禾ZT含量顯著下降，但變化幅度因種質(zhì)材料的不同而不同。輕度(75%～85%)、中度(55%～65%)和重度脅迫(35%～45%)下，AD和XH葉片ZT含量較對照均顯著下降。嚴(yán)重脅迫下(15%～25%)，AD和XH葉片ZT含量繼續(xù)下降至最低，分別為62.28、63.42 ng/g。干旱脅迫使AD葉片ZT的含量下降幅度最大，與對照相比，下降了62.45%(圖1)。

圖1 草地早熟禾葉片ZT含量Fig.1 Changes of ZT in leaves of indigenous

2.2.2 干旱脅迫下草地早熟禾葉片IAA含量變化 干旱脅迫下，草地早熟禾葉片IAA含量變化趨勢相同，均先上升后下降。輕度脅迫(75%～85%)促進(jìn)IAA含量的增加，其增加幅度存在差異，XH葉片IAA含量達(dá)到峰值，為690.84 ng/g，但明顯低于AD；中度脅迫(55%～65%)下，XH葉片IAA含量下降而AD葉片IAA含量繼續(xù)上升至峰值，為796.36 ng/g。隨著脅迫程度的繼續(xù)加大，AD和XH葉片的IAA含量均下降。脅迫末期，IAA含量均降至最低，分別為374.40、310.94 ng/g(圖2)。

2.2.3 干旱脅迫下草地早熟禾葉片ABA含量變化 干旱脅迫促進(jìn)ABA含量的積累。輕度脅迫下(75%～85%)，ABA含量較對照顯著增加；中度脅迫下(55%～65%)，ABA含量變化存在明顯差異，其中，XH葉片ABA含量顯著降低，而AD葉片ABA含量繼續(xù)增加并且達(dá)到峰值為443.98 ng/g；重度脅迫下(35%～45%)，ABA含量均下降，其中，XH葉片ABA含量降至最低；嚴(yán)重脅迫下(15%～25%)，AD葉片ABA含量下降，而XH葉片ABA含量略微上升，但均顯著高于對照，干旱脅迫使AD葉片ABA含量增加幅度最大，為73.95%(圖3)。

圖2 草地早熟禾葉片IAA含量Fig.2 Changes of IAA in leaves of indigenous bluegrass

2.2.4 干旱脅迫下草地早熟禾葉片ZT/ABA,ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA變化 干旱脅迫下， ZT/ABA和(ZT+IAA)/ABA總體呈下降趨勢，ZT/IAA先下降后上升，但較對照顯著下降(表1)。其中ZT/ABA下降幅度最大，在70.69%～77.94%；其次為(ZT+IAA)/ABA，下降幅度為64.85%～70.29%；下降幅度最小的是ZT/IAA，在20.00%～29.17%。

圖3 草地早熟禾葉片ABA含量Fig.3 Changes of ABA in leaves of indigenous bluegrass

脅迫期間，ZT/ABA、ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA變化幅度因脅迫程度的不同而不同。其中輕度(75%～85%)和中度(55%～65%)脅迫下，三者下降幅度最大，顯著低于對照。重度脅迫(35%～45%)下，(ZT+IAA)/ABA和ZT/ABA繼續(xù)下降，和中度脅迫相比，均差異顯著。嚴(yán)重脅迫下，(ZT+IAA)/ABA和ZT/ABA繼續(xù)下降至最低，與重度相比，前者差異顯著，后者無顯著性差異。整個脅迫期間，AD葉片ZT/ABA、ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA下降幅度最大。

表1 草地早熟禾葉片ZT/ABA,ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABATable 1 Changes of ZT/ABA,ZT/IAA and (ZT+IAA)/ABA in leaves of indigenous bluegrass

3 討論與結(jié)論

3.1 干旱脅迫對草地早熟禾葉片內(nèi)源激素含量的影響

3.1.1 干旱脅迫對葉片ZT含量的影響 ZT是植物體內(nèi)最常見的細(xì)胞分裂素,其促進(jìn)細(xì)胞分裂、擴(kuò)大，側(cè)芽發(fā)育，還促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)移動和延遲衰老[11]，與植物抗逆性密切相關(guān)。水分脅迫期間ZT含量的降低，有利于植物保持較高的水分，是一種保護(hù)性的生理反應(yīng)[12]。脅迫期間葉片ZT含量降低，導(dǎo)致植株生長速率減慢,從而緩解了干旱造成的壓力。抗旱能力越強(qiáng)，自身調(diào)節(jié)能力就越大，即水分脅迫下ZT的合成越少[4]。脅迫期間安定野生草地早熟禾葉片ZT含量下降最明顯，脅迫末期ZT含量只有對照的37.55%，說明安定野生草地早熟禾對干旱的耐受性較強(qiáng)。

3.1.2 干旱脅迫對葉片IAA含量的影響 試驗(yàn)研究中水分脅迫初期，IAA含量呈上升趨勢，表明輕度干旱不足以對草地早熟禾的生長構(gòu)成威脅，此時植物仍在生長，隨脅迫程度的繼續(xù)增加，IAA含量下降，可能是因?yàn)橹囟让{迫下，IAA的合成部位受損，無法繼續(xù)合成IAA，植物通過抑制自身的生長來抵御干旱，總體而言，干旱脅迫下IAA含量與對照相比顯著下降，這與Wang等[13]的研究結(jié)果一致。然而，在茶樹和棉花等[14-17]研究中，干旱脅迫促進(jìn)了IAA的積累，有關(guān)水分狀況和內(nèi)源IAA水平之間的關(guān)系，迄今為止還有爭議，其內(nèi)在機(jī)制尚需深入研究[18]。

3.1.3 干旱脅迫對葉片ABA含量的影響 ABA作為一種信號傳導(dǎo)因子，主要由根產(chǎn)生,能夠促進(jìn)休眠、抑制生長、還可以促進(jìn)氣孔關(guān)閉和促進(jìn)根系水分吸收[18，19]。輕度和中度干旱脅迫下，ABA含量積累較多，說明其在逆境下對環(huán)境變化的潛在適應(yīng)性較強(qiáng)，然而這種適應(yīng)性是有限度的，隨著脅迫程度的繼續(xù)加重，這種自我保護(hù)的機(jī)制會遭到破壞，從而使ABA含量下降。總體分析，草地早熟禾葉片ABA含量，均隨脅迫程度的增加，呈上升趨勢，趙文魁等[19]研究也得到了相似的結(jié)論，ABA能夠增加植物根部的水分吸收，促使葉片氣孔開度受抑或關(guān)閉，水分蒸騰減少，最終植物的保水能力提高。

很多學(xué)者認(rèn)為，品種的抗旱性與ABA的積累密切相關(guān)，抗旱性越強(qiáng)，ABA含量增加速度越快，積累能力越強(qiáng)[18,20]，干旱脅迫下，安定野生草地早熟禾葉片ABA含量增加幅度最大，比對照增加了73.95%，初步推測安定野生草地早熟禾抗旱性強(qiáng)于西和野生草地早熟禾，然而ABA的積累又會引起葉片脫落，加速植株衰老。因此,干旱脅迫下植物體內(nèi)積累的ABA并不是越多越好，此次試驗(yàn)ABA含量在脅迫后期下降正好說明這一點(diǎn)。

3.1.4 干旱脅迫對草地早熟禾葉片ZT/ABA,ZT/IAA,(ZT+IAA)/ABA的影響 隨著干旱脅迫強(qiáng)度的增加，安定和西和野生草地早熟禾葉片的ZT/ABA、ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA呈下降趨勢，這3種激素相互抑制，相互促進(jìn)，共同參與了代謝平衡，干旱脅迫期間，IAA，ZT和ABA的變化總是向著促進(jìn)氣孔關(guān)閉，減緩生長發(fā)育，維持細(xì)胞膨壓的方向代謝，以便植物最優(yōu)化地利用有限水分，這在很多研究中得到了證明[21，22]。安定野生草地早熟禾葉片的ZT/ABA，ZT/IAA和(ZT+IAA)/ABA下降幅度大于西和野生草地早熟禾，表明其應(yīng)對干旱脅迫的能力強(qiáng)于后者。

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