干旱脅迫下老芒麥遺傳多樣性分析

陳 云，閆偉紅，吳 昊，曲志才

(1.曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165；2.中國農業科學院草原所，內蒙古 呼和浩特 010010)

水分脅迫是植物生長發育過程中最易遭受到的生態脅迫因子[1]。研究報道，植物的抗旱性包括系統抗旱性和細胞抗旱性，二者都是由于植物體內相關基因表達的結果[2]。小麥對干旱脅迫的響應過程包括脅迫感受、滲透調控反應、激素反應、信號轉導、基因表達調控、氣孔運動、形態及生長速率變化等多個環節的協同作用，是一個多途徑、多水平的調控過程。這個過程同時也是植物在長期進化過程中經過自然選擇與人工選擇而獲得的對環境的適應性過程[3]。植物抗旱性和遺傳多樣性是環境選擇的結果，評價植物的抗旱性和遺傳多樣性可以了解它們的生態適應性，為研發和推廣抗旱品種提供理論依據。

有關植物種質資源抗旱性的評價，國內外已有許多報道，但大多側重于植物形態及生理生化特性等方面。曾怡[4]以川西北高原的野生老芒麥種質資源為供試材料，通過對萌發期、苗期至開花期干旱脅迫條件下的生理生化、生長特性、生物量等指標的觀測，探討了干旱脅迫對老芒麥的影響，篩選出鑒定老芒麥抗旱性的重要指標。對以色列野生二粒小麥的研究發現，不同生態區干旱脅迫環境造成非編碼區的微衛星序列的遺傳變異和分化，致使其重復次數發生相應變化[5]。Esmaeilzadeh等[6]以AFLP分子標記和某些農藝性狀評價面包小麥基因型耐旱的遺傳多樣性，發現AFLP分析的聚類結果與農藝性狀的聚類存在相關性。對棉花耐旱相關種質的遺傳多樣性分析表明，高抗材料之間的遺傳關系較遠，其抗旱性來源于不同的遺傳基礎，而不抗旱材料之間的遺傳關系較近[7]。韓瑞宏等[8]研究了干旱條件下草坪草的生態適應性,細胞膜、細胞壁、葉綠體超微結構的變化,草坪草對干旱脅迫的生理生化反應,以及提高草坪抗旱性的途徑。至于干旱脅迫對老芒麥遺傳多樣性的影響，國內外報道較少。從干旱脅迫下遺傳特性響應機制方面，研究不同生境下老芒麥耐旱的遺傳特性，為篩選高抗旱性材料，合理開發老芒麥種質資源和遺傳育種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料老芒麥均由中國農業科學院草原研究所提供，所有材料均采自野外，經異地擴繁及農藝性狀評價，從中篩選出20份性狀優異的老芒麥，其物候期較長、穗大、牧草產量高、抗逆性較強(表1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 稱取每份材料100 mg，液氮研磨至粉狀后，采用改良的CTAB法提取老芒麥基因組DNA[9,10]，以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，置于-20 ℃備用。

表1 供試材料老芒麥序號及產地Table 1 The information of tested Elymus sibiricus

1.2.2 SSR-PCR 參照文獻[11]的體系加以優化，實驗的最適體系為20 μL反應體系，即25 mmol/L MgCl21.6μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，10(Buffer緩沖液2.0 μL，10 μmol/L上下游引物各0.6 μL，1 UTaqDNA聚合酶0.2 μL，模板DNA 0.5 μL。擴增程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性60 s，50～59 ℃退火45 s (依具體引物對而定)，72 ℃延伸60 s，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴增產物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 數據處理

在老芒麥PCR擴增產物的電泳圖譜中，每個條帶視為一個基因位點，按同一位置上DNA條帶的有無進行統計，有帶的標記為“1”，無帶的標記為“0”，缺失記為“2”，得到1，0數據矩陣。分別應用NTSYSpc2.1[12]軟件和POPGEN 32軟件，以非加權組平均法(UPGMA) 為手段進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 老芒麥基因組DNA提取及電泳鑒定

以改良的CTAB法提取的老芒麥基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，大部分材料的基因組DNA純度較高、蛋白質等雜質殘留較少，可用于SSR標記分析。

2.2 SSR分子標記檢測

用PEG-6000模擬自然狀態下的干旱環境，對20份地理距離遠且形態學差異較大的供試老芒麥材料進行脅迫處理，然后篩選出多態性高、條帶清晰、重復性好的10對引物進行SSR-PCR擴增，總擴增帶數115條，大小多集中在500～2 000 bp，平均每個引物對擴增出11.5條(圖2)，其中，多態性帶數為103條，占總條帶數的89.57%，平均每個引物對產生10.3條(表2)；多態性信息含量(PIC)為0.255～0.473，平均為{0.368})，SSR標記效率(MI)為3.87(表2)；多態性條帶百分率在70%～100%，表明老芒麥有很豐富的遺傳多樣性。

2.3 供試材料的遺傳距離分析

擴增產物采用Nei[13]的計算方法得到供試材料的遺傳距離矩陣，20份老芒麥的遺傳距離值在1.03～9.97(表3)；由矩陣圖可以看出，來自內蒙錫盟太旗崩崩山試驗地的13號材料和來自新疆伊犁州特克斯縣城北種牛場的14號材料之間的遺傳距離最小，表明二者親緣關系較近；而來自新疆博州溫泉縣西阿拉套山口的3號材料和來自新疆伊犁州昭蘇縣城北的4號材料之間的遺傳距離最大，說明二者親緣關系較遠，這也反映了同一產地的老芒麥材料之間親緣關系并非較近，產地距離較遠的老芒麥材料之間親緣關系也并非較遠，這一趨勢與干旱脅迫之前的結果一致。

圖1 46-47引物對對20份老芒麥的PCR擴增產物Fig.1 PCR product of 20 accessions of Elymus sibiricus amplified by 46～47 primer pairs

注：泳道M,DNA標準分子量(DL 2000)，1～20號泳道對應表1中的1～20號材料的基因組DNA擴增結果

表2 SSR引物序列及其擴增結果Table 2 The SSR primer sequences and its amplification

表3 20份老芒麥品種間的遺傳距離Table 3 The genetic distance of 20 accessions of Elymus sibiricus based on the software of Ntsyspc-2.10

注：根據Ntsyspc-2.10軟件得出

經POPGENE 32軟件處理，可知老芒麥居群間的遺傳距離介于0.160 0～0.894 8(表4)，差異比較大，表明干旱脅迫后的老芒麥的遺傳差異性較高，遺傳變異較廣。

表4 20份老芒麥之間的遺傳距離Table 4 The genetic distance of 20 accessions of Elymus sibiricus based on the software of POPGENE 32

注：根據POPGENE 32軟件得到

2.4 干旱脅迫前后的聚類分析

2.4.1 以NTSYSpc 2.1軟件處理的聚類圖與三維圖 干旱脅迫前的聚類圖表明，在遺傳距離為0.57處20份供試材料被聚為兩類，來自西藏的18,19號材料聚為一類，其余的材料聚為一類，在遺傳距離為0.62處第1大類又被分為2類(圖2)，即1,2,3,14,4,5,15,16聚在一起，6,9,10,8,7,11,13,17,12聚在一起。

脅迫處理后的老芒麥，在遺傳距離為0.36處分為兩類，即Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ兩大類，除7號材料外其余材料歸為一類，在遺傳距離為0.50處第Ⅰ大類又被分為Ⅰ和Ⅱ兩類(圖2B)，1，10，2，3，4，5，8，13，14，15，16，6，9，12聚為一類。

圖2 干旱脅迫處理前(A)后(B)老芒麥的類平均法聚類Fig.2 The cluster dendrogram using average linkage clustering of Elymus sibiricus before and after drought stress treatments

以相同軟件構建的老芒麥材料的三維聚類圖可以非常直觀地反映所測試居群的整體結構(圖3)。但脅迫前后的三維圖差別比較明顯。

2.4.2 以POPGENE 32軟件處理的聚類圖 由圖4可以看出不同軟件處理的聚類結果基本一致，且脅迫前的聚類結果明顯不同于脅迫后的聚類結果。

2.4.3 干旱脅迫前后的聚類結果比較 比較干旱脅迫前后的聚類結果發現，脅迫前來自新疆的4、5號材料聚為一類，而干旱處理后4號卻與同樣來自新疆的2、3號聚在一起，5號材料與來自甘肅的8號材料聚為一類；脅迫前來自內蒙的7號和13、17號聚在一起，而處理后7號卻單獨聚為一類；脅迫前來自內蒙的10號材料與來自新疆的6、9號，甘肅的8號材料聚在一起，而脅迫處理后10號卻與來自新疆的1號聚在一起，這表明干旱脅迫前后聚類結果差別較大。

圖3 干旱脅迫處理前(A)后(B)老芒麥的三維圖Fig.3 Three dimensional diagram of 20 accessions of Elymus sibiricus before and after drought stress treatments

注：A,B,C分別對應圖2中的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ

圖4 干旱脅迫處理前(A)后(B)老芒麥的類平均法聚類Fig.4 Figure 2 The cluster dendrogram using average linkage clustering of Elymus sibiricus before and after drought stress treatments

3 討論

3.1 脅迫處理前材料的遺傳多樣性分析

干旱脅迫處理前聚類(圖2A)表明，采自新疆的1,2,3,14,4,5號材料聚在一起，采自內蒙的7,13,17號材料聚在一起，采自西藏的18，19號材料聚在一起，表明產地相同的材料大多聚為一類，但同樣是采自青海的12和15號材料，同樣是采自內蒙的10號和16號材料卻不聚在一起，表明聚類結果與其地理來源并非完全一致。其原因可能有兩方面，一是有些地區采集的樣本數量有限，例如山西和青海地區僅采集了一份樣本，這在一定程度上使得聚類結果精確性降低，研究報道表明遺傳多樣性水平和群體樣本數量間存在明顯的相關性，為此，未來在采樣時應充分考慮樣本數量和采集地范圍的大小，減小因材料數量太少、來源過于集中對研究結果造成的影響[14-16]。二是基因突變，不同產地的樣本在異地擴繁多年，受擴繁環境的影響程度不同，以及對不利環境的耐受性不同，可能引起耐受性低的材料有關基因發生突變，并且這種變異能夠遺傳。

3.2 脅迫處理后材料的遺傳多樣性分析

20份老芒麥的SSR-PCR分析顯示多態性條帶百分率在70%～100%，而不同地域居群間的遺傳距離介于0.160 0～0.894 8，差異比較大，說明其遺傳分化程度較高，遺傳多樣性豐富，遺傳變異較廣。多態性信息含量(PIC)為0.255～0.473，平均為0.368，SSR標記效率(MI)為3.87，說明運用SSR分子標記能夠較好地揭示野生老芒麥的遺傳多樣性及親緣關系。

試驗研究中，供試材料的Nei’s 遺傳多樣性指數(He)為0.332 4，明顯高于單子葉植物Nei’s 遺傳多樣性的平均值0.190[17]，Shannon’s 信息多樣性指數Ho為0.492 6，同樣表明老芒麥不同居群間的遺傳多樣性較高。從DNA分子水平上證實了老芒麥遺傳多樣性豐富，有大量可供選擇利用的優異性狀和種質資源[16]。因此，應深入研究和合理開發利用老芒麥遺傳種質資源，提高其產量和擴大種植范圍，提高其利用率。

脅迫處理后的聚類圖(圖2B)表明，第Ⅰ大類中1,2,3,4,5,14,6,9均采自新疆，但6號和9號與其他6份材料遺傳距離仍然較遠，15和12號材料均采自青海，但二者遺傳距離也較遠，其原因與脅迫前相同，主要是耐受異地環境影響的能力不同。

脅迫后原來與新疆6號和9號聚在一起的內蒙10號材料卻與新疆的1,2,3,4,5號材料聚在一起，之前與內蒙13,17號材料聚在一起的7號材料在干旱處理后卻單獨聚為一類，脅迫前內蒙13,17號材料遺傳距離較近，經干旱處理后遺傳距離變得較遠，推測其原因可能是采自內蒙的供試材料由于適應了特定的生境條件，對干旱模擬較為敏感，造成非編碼區的微衛星序列的遺傳變異和分化或微衛星不穩定等，致使其重復次數發生相應變化[5]，由于干旱脅迫下信號傳遞和基因表達及其調控非常復雜,對干旱敏感的基因和抗干旱基因的突變分析仍比較困難,因此，必須在此領域進行深入廣泛的研究[18]。

3.3 脅迫前后聚類結果的比較

POPGENE軟件比NTSYS軟件運行簡便、快捷，且可以測多種遺傳多樣性參數，包括等位基因數，Nei’s遺傳多樣性指數，Shannon’s多樣性信息指數，多態位點百分率，遺傳分化值，基因流等。試驗使用兩個軟件處理遺傳多樣性參數，所得聚類結果基本一致。

基于干旱脅迫前后老芒麥的聚類結果，比較發現脅迫前后差異較大。有兩方面原因：(1)適應特定生境的老芒麥對干旱模擬較為敏感，造成非編碼區的微衛星序列的遺傳變異和分化或微衛星不穩定等，致使其重復次數發生相應變化[5]；(2)由于老芒麥受生境條件的影響較大，在地理距離較小時，干旱產生的差異性較為突出；隨著地理距離的增大，地理位置產生的差異超出干旱引起的差異，這與一些學者的研究結果一致。通過研究氣候效應對以色列二粒小麥微衛星多樣性的影響，發現在地理范圍較大時小氣候的選擇作用阻礙了基因漂移，從而造成較大的遺傳分化[19]。在研究歐洲鹽沼披堿草屬的種群遺傳結構時，發現在小地理范圍(<100 m)下，具有獨特生境的披堿草居群有很明顯的遺傳變異，超過60 km時，地理距離隔離造成的影響變弱，并總結出總遺傳變異的14%是由生境造成的，8.9%與地理距離有關[20]，進一步肯定了生境條件對披堿草屬植物遺傳變異的影響。遺傳上的變異是物種進化和選擇的基礎，在育種上的地位十分重要[21]。因此，應采取適當的措施妥善保存并合理開發利用。

干旱脅迫處理的20份不同居群的老芒麥遺傳多樣性豐富，多態性比例為89.565%，SSR標記效率(MI)為3.87，Nei’s遺傳多樣性指數(He)為0.332 4，Shannon指數(Ho)為0.492 6。脅迫處理材料與同批材料脅迫前的聚類結果差異較大。脅迫前后UPGMA聚類都表明產地相同的材料大多聚為一類，但不完全一致，其中來自內蒙古的材料脅迫前后差異較大。

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