黃鱔α-淀粉酶全長cDNA的克隆與序列分析

孟冉 阮國良 楊代勤

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)(長江大學動物科學學院，湖北荊州434025;淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心，湖北武漢430070;濕地生態與農業利用教育部工程研究中心，湖北荊州434025)(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

α-淀粉酶(α-1,4-葡萄糖-4-葡聚糖水解酶)屬于α-淀粉酶家族，普遍存在于動植物以及微生物中，其主要功能是水解淀粉中的α-1,4-糖苷鍵[1]。哺乳動物主要有唾液淀粉酶[2]和胰淀粉酶[3,4]2種α-淀粉酶，而魚類只有(肝)胰腺產生α-淀粉酶。魚類α-淀粉酶是重要的碳水化合物水解酶之一，它能夠水解食物中的淀粉，其分泌功能的強弱直接影響到魚類對食物的消化能力。已有研究表明[5]，魚類α-淀粉酶的活性與魚類食性、生長、分布、季節變化及其發育階段等因素有關。

黃鱔(Monopterusalbus)是我國重要的名特水產養殖魚類，屬于合鰓目合鰓科黃鱔屬，是雜食性魚類。目前對黃鱔消化酶的研究主要集中在理化壞境和營養素對其活性影響方面[6-9]，對于黃鱔α-淀粉酶基因序列還未見報道。因此，克隆黃鱔α-淀粉酶基因可以為魚類消化酶基因表達調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需的黃鱔來自長江大學黃鱔研究所，健康無傷病。RNA提取試劑盒、pMD18-T載體試劑盒、PCR試劑及普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自Takara公司。反轉錄試劑盒由Fermentas公司生產。SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit為Clontech公司產品。質粒提取試劑盒購自Omega公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。引物由北京鼎國昌盛生物技術有限公司合成。其他試劑均為國產分析純。

1.3 RNA提取和cDNA的合成

按照RNA提取試劑盒操作說明提取黃鱔肝臟組織RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，然后參照Fermentas公司的ReverAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit方法以及SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書合成cDNA和5’、3’RACE cDNA，反轉錄產物置于-20℃保存。

1.4 引物的設計與合成

根據斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)(ACJ26844.1)、人(Homosapiens)(AAA35525.1)、小鼠(Musmusculus)(CAA24098.1)的α-淀粉酶基因設計兼并引物擴增黃鱔α-淀粉酶基因中間片段，擴增全長引物根據黃鱔α-淀粉酶基因中間片段設計。引物設計采用Primer5.0，引物見表1。

表1 黃鱔α-淀粉酶基因PCR引物

1.5 黃鱔α-淀粉酶基因的擴增

1.5.1 黃鱔α-淀粉酶中間片段的擴增

以黃鱔cDNA為模板，用α-F和α-R引物進行PCR擴增。PCR反應體系為：10×PCR Buffer(無Mg2+)2.5μl，25mmol/L Mgcl22μl，2.5mmol/L dNTPs 2μl，α-F(10μmol/L)1μl，α-R(10μmol/L)1μl，Taq酶0.5μl(1μl/U)，模板cDNA 1μl，加ddH2O至25μl。反應條件：94℃預變性4min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環，然后72℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化回收后連接到PMD18-T載體，連接產物轉化至感受態細胞DH5α，用氨芐抗性篩選后送至武漢鼎國昌盛生物技術有限公司測序。

1.5.2 黃鱔α-淀粉酶基因5’、3’ cDNA擴增

分別以黃鱔3’RACE和5’RACE cDNA為模板，用3’特異性引物(α-P1，α-P2)和5’特異性引物(α-R1，α-R2)與SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒提供的通用引物(UPM)配對進行PCR擴增，PCR擴增按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒所推薦的反應體系和反應條件進行，然后對產物進行回收純化、克隆與測序。

1.6 序列的生物信息學分析

運用ORF finder server(ORFs)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)尋找開放閱讀框，利用在線軟件ProtParam(http://www.expasy.ory)進行蛋白質分子量、等電點分析，用MEGA 4.1軟件的鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構建系統進化樹，并用Bootstrap重復1000次計算各分支的置信值。氨基酸序列同源性分析使用DNAStar軟件MegAlign功能進行。

2 結果與分析

2.1 黃鱔α-淀粉酶cDNA序列及推導氨基酸序列

黃鱔α-淀粉酶基因cDNA序列全長為1607bp，其中包括2bp的5’非編碼區(UTR)，54bp的3’非編碼區(UTR)，開放閱讀框(ORF)長1551bp，編碼516個氨基酸，含有20個氨基酸殘基組成的信號肽(圖1)，推測其蛋白質分子量為58201.52，等電點約為7.23，分子式為C2588H3892N742O746S27，不穩定系數為30.57。

2.2 黃鱔α-淀粉酶蛋白序列比對及同源性分析

對黃鱔及斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)、大西洋鮭(Salmosalar)、日本鰻鱺(Anguillajaponica)、斑馬魚(Daniorerio)、草魚(Ctenopharyngodonidella)、人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)的α-淀粉酶氨基酸序列進行多重比對，其相似性分別為84.2%、78.7%、77.8%、77.1%、77.1%、74.2%、69.9%、69.5%。比對結果顯示黃鱔α-淀粉酶包含與哺乳動物α-淀粉酶二級結構相似的8個α螺旋和7個β折疊，沒有第7個β折疊。在哺乳動物中保守的10個形成二硫鍵的的半胱氨酸(Cys)在黃鱔中同樣保守[10](圖2)。

注：起始密碼子由方框圈示，終止密碼子以*表示，灰色陰影顯示加尾信號，預測的信號肽用下劃線表示。圖1 黃鱔α-淀粉酶基因cDNA序列和推導的氨基酸序列

2.3 黃鱔α-淀粉酶蛋白系統進化樹的構建

利用NCBI上其他物種α-淀粉酶基因和黃鱔α-淀粉酶基因，采用MEGA4.1構建系統進化樹，相關GenBank登錄號分別為：斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)(ACJ26844.1)、人(Homosapiens)(AAA35525.1)、小鼠(Musmusculus)(CAA24098.1)、斑馬魚(Daniorerio)(NP_998176.2)、爪蟾(Xenopuslaevis)(AAH56841.1)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)(AGT37610.1)、大西洋鮭(Salmosalar)(ABD13895.1)、尖吻鱸(Latescalcarifer)(AAL84163.1)、赤鯛(Pagruspagrus)(AAU93830.1)、泥塘幼鯔(Chelonlabrosus)(AIC81809.1)、草魚(Ctenopharyngodonidella)(ACX35465.1)、重牙鲆(Diplodussargus)(ABX89620.1)、長鰭籃子魚(Siganuscanaliculatus)(AHN13897.1)、猿鳚(Cebidichthysviolaceus)(ABK57091.1)、黑劍帶鳚(Xiphisteratropurpureus)(ABJ97444.1)、日本鰻鱺(Anguillajaponica)(BAB85635.1)、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)(ABQ45553.1)、美洲黃蓋鰈(Pseudopleuronectesamericanus)(AAF65827.1)，結果如圖3。分析顯示鯉科魚類草魚和建鯉(Cyprinuscarpio‘jian’)聚為一支，兩者與日本鰻鱺獨聚為一支，最后又與黃鱔聚為一支。

注：黑體加粗字體顯示為黃鱔。圖3 α-淀粉酶cDNA編碼的氨基酸序列構建的系統進化樹

3 討論

本研究克隆了黃鱔α-淀粉酶基因的cDNA全長。氨基酸相似性分析顯示黃鱔α-淀粉酶基因與其他魚類的α-淀粉酶基因相似性高于哺乳動物。進化樹分析顯示，魚類α-淀粉酶基因聚為一支，哺乳類另聚一支。斑馬魚和胭脂魚α-淀粉酶基因與一些海水魚類α-淀粉酶基因構成一個分支，黃鱔和草魚、建鯉、日本鰻鱺α-淀粉酶基因組成另一個小分支，而長鰭籃子魚獨成一支，這暗示魚類α-淀粉酶基因在進化過程中存在一定的差異，魚類α-淀粉酶基因可能存在不同的家族成員[11]。

哺乳動物胰淀粉酶有3個功能域：A、B、C[12],其中功能域A的(α/β)8桶裝結構存在氯離子結合區域;功能域B存在鈣離子結合部位，是維持α-淀粉酶結構穩定所必需的。有報道顯示功能域A(α/β)8桶裝結構是α-淀粉酶的催化功能域，其中β3、β4、β5和β7區域的一些氨基酸十分保守[13]。本研究結果顯示黃鱔在β3、β4、β5區域的某些氨基酸十分保守，而β7區域卻不保守，黃鱔β7保守性差異是否與其催化活性相關還有待于進一步研究。

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