反相高效液相色譜法測定三尖杉中三尖杉酯堿研究

江慧，胡奎，王凡 劉先福，李俊凱

（長江大學農學院，湖北荊州434025）

三尖杉屬（Cephalotaxus）是裸子植物中的一個小屬，分布于東亞及中南半島北部，主產于中國，在長江以南各地均有分布，主要分布在云南、海南等地［1］。三尖杉酯堿是我國特產的三尖杉屬植物中分離的抗腫瘤生物堿之一［2］，主要用于治療急性早幼粒細胞白血病、急性單核細胞性白血病、急性粒細胞性白血病及惡性淋巴瘤等，并有較好的治療效果［3－5］。其用藥劑量少，作用原理比較獨特，與常用的抗白血病藥物無交叉耐藥性，在我國已經廣泛應用于臨床。但是，由于過度開發利用及生存環境的惡化，造成我國的三尖杉植物幾近滅絕，現在該樹種已經被列為國家野生植物保護品種，資源極其缺乏，而且落后的分離檢測技術也限制了三尖杉植物的合理使用［6－7］。

目前，國外有關三尖杉酯堿測定的報道很多，但應用高效液相色譜法檢測的卻很少［8－10］。因此，建立高效液相色譜法為尋找新的三尖杉植物資源、開發新的三尖杉生物堿提純分離技術、發現新的有效或可以用作半合成的化合物對深入三尖杉生物堿的研究、提高有限資源的利用率都有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC－10Avp高效液相色譜儀及工作站（帶UV－Vis檢測器及Class－vp色譜工作站），0.22μm微孔過濾器、旋轉蒸發儀RE－52（上海亞榮生化儀器廠）。

三尖杉酯堿標準品購自國家標準物質中心；三尖杉植物樣品產品由長江大學生命科學院提供；乙酸銨、氨水、酒石酸、三氯甲烷、乙酸乙酯、無水碳酸鈉均為分析純，甲醇為色譜純。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

采用ODS－C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；以甲醇∶0.02mol·L－1乙酸銨溶液（體積比48∶52）為流動相，流速1.0ml·min－1，柱溫40℃，檢測波長296nm，進樣量20μl。

1.2.2 標準品溶液配制

精密稱取10.00mg三尖杉酯堿標準品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容得0.2mg·ml－1母液。精密量取適量母液，分別用甲醇稀釋成含三尖杉酯堿10.0、5.0、2.5、1.0、0.5mg·L－1系列標準溶液，冰箱4℃保存備用。

1.2.3 樣品的前處理

稱取三尖杉植物樣品20.00g，浸泡于80ml甲醇中，水浴回流24h，浸提3次，將浸提液減壓蒸干回收甲醇后，用40ml酒石酸（3%）水溶液溶解浸膏，溶液用30ml乙酸乙酯萃取3次，水層用飽和碳酸鈉溶液調pH至8左右，然后用30ml氯仿萃取3次，將氯仿萃取液蒸干，用甲醇溶解，定容至2ml，待測［11］。

1.2.4 方法的準確度和精密度測定

設置0.5、1.0、5.0mg·L－13個添加濃度，每個濃度重復3次，再按前述樣品處理方法處理后測定添加回收率及相對標準偏差（RSD）。

2 結果與分析

2.1 三尖杉酯堿高效液相色譜分析的色譜圖

將三尖杉酯堿標準溶液分別在前述色譜條件下進行測定，以峰面積對濃度進行線性回歸，得到回歸方程為Y＝3762.7 X－354.96（r＝0.9998），保留時間為29.337min。表明在該色譜條件下，樣品峰與雜質峰能較好地分離（圖1），可見該方法具有良好的線性相關性。

圖1 三尖杉酯堿標準品色譜圖

2.2 方法的準確度和精密度

按前述色譜條件進行分析，計算其平均回收率在88.1～95.4%之間，相對標準偏差（RSD）小于3.6%。（表1）。

表1 添加回收率測定結果

2.3 實樣檢測

三尖杉植物樣品按前述方法對其進行測定，結果顯示，植物樣品被檢測出含有三尖杉酯堿，其濃度為4.3mg·L－1，植物樣品色譜圖如圖2所示。該檢測結果表明，該方法可以滿足對植物樣品中的三尖杉酯堿測定的要求。

圖2 植物樣品色譜圖

3 小結

三尖杉酯堿為三尖杉屬植物中的一種生物堿，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿等有機溶劑。在反相高效液相色譜分析時，流動相中加入少量乙酸銨，有利于改善峰型，防止色譜峰拖尾現象。

本研究建立了反相高效液相色譜－紫外法（HPLC－UV）測定三尖杉植物樣品中三尖杉酯堿的方法。在該方法下，樣品的回收率穩定，精密度及準確度較好，適用于對三尖杉中三尖杉酯堿的測定。

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