山楂葉總黃酮制備工藝參數(shù)的研究

夏成凱

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230001;亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800)

李靜

(亳州市食品藥品檢驗(yàn)所， 安徽 亳州 236800)

汪電雷

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230001)

山楂葉為薔薇科植物山里紅(Crataeguspinnatifida Bge.var:m a jor N.E.Br:)或山楂(Crataeguspinnatifida Bge.)的干燥葉和花[1]，具有悠久的保健和藥用歷史。近年來(lái)隨著提取工藝、檢測(cè)手段完善，在山楂葉的研究方面有了重大的進(jìn)展，從山楂葉中提取出的總黃酮目前已制成益心酮片，主要用于胸悶憋氣，心悸健忘，眩暈耳鳴及冠心病、心絞痛等癥，同時(shí)用于抗衰老等方面[2]。山楂葉總黃酮制備工藝在《中國(guó)藥典》2010版一部“益心酮片”制法中沒(méi)有明確溶劑用量等工藝參數(shù)，故我們對(duì)山楂葉總黃酮的制備工藝參數(shù)進(jìn)行考察確定。

1 儀器與材料

DGX-8243B型高溫恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)；UV-8000S紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；R201B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮科技有限公司)；山楂葉(購(gòu)自亳州市中藥飲片廠)經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院院長(zhǎng)劉耀武副教授鑒定為薔薇科植物山楂的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 山楂葉出粉率的考察

表1 山楂葉粗粉出粉率的考察

表2 山楂葉粗粉對(duì)溶媒吸收率的考察

取烘干后的山楂葉藥材各3份，每份100g，參照《中國(guó)藥典》2010版一部粉末分等，粉碎成粗粉，所有通過(guò)二號(hào)篩，但混合用四號(hào)篩不超過(guò)40%的粉，過(guò)篩，記錄粗粉量。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 山楂葉粗粉滲漉時(shí)溶媒用量的考察

2.2.1 山楂葉粗粉對(duì)溶媒吸收率的考察 取山楂葉粗粉各3份，每份100g,分別加入6、8、10倍量乙醇浸泡4h，浸泡后過(guò)濾，收集濾液。結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可知，滲漉時(shí)山楂葉粗粉對(duì)溶媒乙醇吸收率約為山楂粗粉的2倍。

2.2.2 山楂葉滲漉時(shí)收集溶媒用量的考察 由于處方中以山楂葉粗粉提取物為原料，滲漉溶劑、溶劑濃度已確定，故我們對(duì)滲漉時(shí)溶媒的用量進(jìn)行考察。

表3 山楂葉滲漉時(shí)收集溶媒用量的考察

取山楂葉粗粉各4份，每份200g，待浸泡24h后，分別收集乙醇滲漉液6、8、10、12倍，按《中國(guó)藥典》2010年版一部“益心酮片”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法測(cè)定山楂葉黃酮的量。結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可知，當(dāng)滲漉收集乙醇量為藥材10倍時(shí)基本提取完全。

含量測(cè)定[3]：①對(duì)照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)120℃ 干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量，經(jīng)超聲處理使溶解，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取20ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml含無(wú)水蘆丁0.20mg)。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分別至25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，使混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min；以相應(yīng)的溶液為空白。照紫外-可見(jiàn)分光光度法(中國(guó)藥典2010年版 一部附錄VA),在500nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，對(duì)照品溶液吸濃度為:8.128、16.256、24.384、35.512、40.64、48.268μg/ml時(shí)，其吸光度值分別為:0.086、0.176、0.266、0.355、0.452、0.528。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)圖1。③測(cè)定法：精密量取滲漉液1ml,置25ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“加水至6ml”起，依法測(cè)定吸收度，并取同樣量的供試品溶液加水至25ml作空白。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量，計(jì)算，即得。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 山楂葉滲漉速度的考察

在滲漉溶劑、溶劑濃度及用量已確定，我們對(duì)滲漉速度進(jìn)行考察。

取山楂葉粗粉各3份，每份200g，待浸泡24h后，分別以3、5、7ml/(min·kg)的速度滲漉，收集乙醇滲漉液2000ml，測(cè)定山楂葉總黃酮的量。結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4可知，滲漉速度為3ml/(min·kg)時(shí)，總黃酮量最高，但滲漉速度為5ml/(min·kg)時(shí)總黃酮量略低，從大生產(chǎn)的生產(chǎn)周期等因素綜合考慮，我們認(rèn)為滲漉速度宜選用5ml/(min·kg)。

表4 山楂葉粗粉滲漉速度的考察

2.4 減壓回收乙醇至一定濃度的考察

取山楂葉粗粉3份，每份200g，照流浸膏劑與流浸膏項(xiàng)下的滲漉法[4](中國(guó)藥典2000年版一部附錄I O)，以乙醇為溶劑，進(jìn)行滲漉，收集滲漉液10倍量，減壓回收乙醇分別至0.5、1.0、1.5g生藥/ml。

1)濃縮至0.5g生藥/ml時(shí)，溶液中乙醇含量高，溶液體積較大。

2)濃縮至1.0g生藥/ml時(shí)，溶液濃度較適宜，相對(duì)密度為1.05，60℃測(cè)。

3)濃縮至1.5g生藥/ ml時(shí)，60 ℃時(shí)溶液較粘稠，不易操作。

2.5 除去色素時(shí)石油醚用量的考察

分別取6份乙醇回收液25ml ，加等量水(即25ml)稀釋后，加入25、20 、15 、10 、5、4ml 的石油醚充分振搖，當(dāng)?shù)?次加入石油醚充分振搖后，分出石油醚層，加入量為5～25ml時(shí)石油醚層為無(wú)色，加入量為4ml 時(shí)石油醚層顏色較淺，除去色素時(shí)石油醚用量為5ml(即1/10量)。

2.6 醋酸乙酯提取條件的考察

2.6.1 醋酸乙酯提取次數(shù)的考察 分別取4份乙醇回收液50ml，加等量水(50ml)稀釋為100 ml，加入10 ml(1/10倍)的石油醚充分振搖除去色素，分出水層，加入量為100 ml 醋酸乙酯分別振搖提取1、2、3、4次，提取液減壓回收醋酸乙酯并濃縮至干，得總黃酮。按照《中國(guó)藥典》2010年版一部“益心酮片”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法測(cè)定山楂葉黃酮的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 醋酸乙酯提取次數(shù)的考察

表6 醋酸乙酯的每次用量的考察

從表5可知，醋酸乙酯提取3次時(shí)基本提取完全。

2.6.2 醋酸乙酯的每次用量的考察 分別取4份乙醇回收液50ml，加等體積水(50ml )稀釋后為100ml ，加入10ml (1/10倍)的石油醚充分振搖除去色素，分出水層，分別加入90、80、70、60ml 醋酸乙酯分別振搖提取3次，提取液減壓回收醋酸乙酯并濃縮至干，得總黃酮，按照《中國(guó)藥典》2010年版一部“益心酮片”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法測(cè)定山楂葉總黃酮的量。結(jié)果見(jiàn)表6。

從表6可知，70ml醋酸乙酯提取3次基本提取完全。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別取山楂葉粗粉各3份，每份200g，照流浸膏與浸膏劑項(xiàng)下的滲漉法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄IO)，以乙醇為溶劑，進(jìn)行滲漉，收集滲漉液10倍量，減壓回收至一定濃度(相對(duì)密度為1.05，60℃測(cè))，加等體積水稀釋后，加入1/10倍量體積的石油醚除去色素，分出水層，用醋酸乙酯振搖提取3次，醋酸乙酯的每次用量為0.7倍，提取液減壓回收醋酸乙酯并濃縮至干，得總黃酮。按照《中國(guó)藥典》2010年版一部“益心酮片”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法測(cè)定山楂葉黃酮的量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 三批驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論

綜合山楂葉的滲漉試驗(yàn)和醋酸乙酯的提取試驗(yàn)結(jié)果，山楂葉總黃酮的最佳工藝條件為：取山楂葉，粉碎成粗粉，照流浸膏與浸膏劑項(xiàng)下的滲漉法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄I O)，以乙醇為溶劑，進(jìn)行滲漉，收集滲漉液10倍量，減壓回收乙醇至一定濃度(相對(duì)密度為1.05，60℃測(cè))，加等體積的水稀釋后，加入1/10倍量體積的石油醚除去色素，分出水層，用醋酸乙酯振搖提取3次，醋酸乙酯的每次用量為0.7倍，提取液減壓回收醋酸乙酯并濃縮至干，得總黃酮。

一般情況下山楂葉提取的方法有以下幾種：水煎煮法，該法提取物粗糙，總黃酮含量低；溶劑萃取法，該法提取物質(zhì)量好，但成本較高，不適宜大批量生產(chǎn)；乙醇滲漉，石油醚除去雜質(zhì)，醋酸乙酯萃取法，該法提取利用溶劑較少，雜質(zhì)也較少，但時(shí)間較長(zhǎng)。綜上我們認(rèn)為第三種方法較好。

在滲漉過(guò)程中，浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，滲漉越完全，提取物含量越高。同時(shí)我們要綜合考慮到影響滲漉的因素，其中包括藥材的粒度，溶媒的濃度、用量，滲漉速度等，在溶媒濃度已確定的情況下，我們重點(diǎn)考察的是滲漉的速度及溶媒用量。

在用醋酸乙酯萃取的過(guò)程中，醋酸乙酯用量較小的時(shí)候，不能夠達(dá)到分離的目的，在不斷添加醋酸乙酯并充分振搖后，醋酸乙酯用量為乙醇濃縮液加等量水后的0.7倍時(shí)完全分離。

[參考文獻(xiàn)]

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