水產品中孔雀石綠殘留檢測前處理方法研究與優化

曹秀梅

摘要：以渭河第二大支流-北洛河為研究對象，于2012年9月對整個水系內13個點位的浮游動物群落進行了調查。結果表明，該流域浮游動物種類有31屬49種，其中輪蟲最多，原生動物次之，分別占種類總數的83.67%和8.16%，浮游動物密度為1.8～479.4 ind./L，平均值為57.7 ind./L，生物量為0.002～0.604 mg/L，平均值為0.070 mg/L。各采樣點浮游動物群落結構存在明顯的空間異質性。基于浮游動物的群落結構特征，根據浮游生物物種多樣性指數結果，對該流域水質狀況進行簡單評價表明，北洛河流域水質處于中度污染，浮游動物群落結構較簡單，需要加大河道管理，防止污染加重。

關鍵詞：北洛河；浮游動物；群落結構；水質評價

北洛河為渭河第二大支流，發源于陜西省榆林地區定邊縣，自西北向東南流經定邊、靖邊、吳旗、志丹、甘泉、富縣、洛川、黃陵、宜君、白水、澄城、蒲城、大荔等13縣，在三河口附近注入渭河，河長680 km。 流域平均寬80 km，總面積2.69 km2，占渭河流域面積的20%。浮游動物（zooplankton）是水域生態系統中重要的生物組成部分，在食物鏈、物質轉化、能量流動、信息傳遞等水域生態過程中起著至關重要的作用［1-2］。目前，在渭河流域水生態環境評價中對浮游動物的關注較少，尤其在北洛河流域，對浮游動物的調查研究幾乎是空白。基于此，本文通過調查浮游動物的種類組成、現存量和多樣性指數等方面對北洛河浮游動物群落結構特征和水體質量進行研究和初步評價，以期為渭河流域水生態系統健康的維護及漁業管理提供基礎數據。

1材料與方法

1.1采樣時間及點位設置

調查于2012年9月進行，根據北洛河水系地形特點，在調查水域共設置13個點位進行樣品采集，這13個點位分別設置在主干流和支流上，其中主干流設置7個點位，各支流設置6個點位（見圖1）。

圖1北洛河流域示意圖

1.2樣品采集與觀察

樣品以采水器在各水層采混合水樣100 L，用25號浮游生物網過濾，將濾取的樣本放入100 mL標本瓶中，加4%～5% 的甲醛溶液固定［3］。固定的樣本在室內靜置24 h后虹吸上清液，濃縮至30 mL。混勻沉淀樣品依據文獻［4-10］，在100～400倍生物顯微鏡（Olympus-CX21）下鑒定浮游動物種類，并記錄個體密度。運用軟件Biodiversity Professional 2.0計算浮游動物多樣性指數：Shannon – Weiner物種多樣性指數（H）、Margalef物種豐富度指數（M）和Pielou均勻度指數（J）。

2結果與分析

2.1浮游動物種類組成及現存量

圖2北洛河流域豐水期浮游動物種類組成

本次調查中，北洛河全流域共鑒定出浮游動物31屬49種，其中原生動物3屬4種，占浮游動物總物種數的8.16% ；輪蟲27屬41種，占總浮游動物總種數的83.67% ；枝角類2屬2種，占總浮游動物總物種數的4.08% ；橈足類2屬2種，占總浮游動物總物種數的4.08%（見圖2）。北洛河流域浮游動物的密度在1.8～479.4 ind./L，平均為57.7 ind./L，浮游動物總密度的高低主要取決于輪蟲的密度。浮游動物生物量為0002～0604 mg/L，平均為0.070 mg/L，輪蟲生物量同樣是北洛河流域浮游動物生物量的主體（見圖3）。

圖3北洛河流域豐水期浮游動物各類群密度和生物量百分比組成

從圖4可以看出，北洛河流域浮游動物多樣性指數（H）變化幅度較大，最大值出現在L5采樣點，指數為3.664，最小值出現在L2和L6采樣點，指數為1.697，平均值2.671。浮游動物豐富度指數（M）變化幅度也較大，最大值出現在L1采樣點，指數值為3.073，最小值出現在L6采樣點，指數為0.768，平均值為1.652。浮游動物均勻度指數（J）變化幅度較小，平均值為0.749。

2.2浮游動物物種多樣性

圖4北洛河流域豐水期浮游動物多樣性

表1浮游生物多樣性指數水質評價標準［11］

生物多樣性指數

無污染

輕度污染

β-中污染

α-中污染

重污染

H＞4.54.5～33～22～1＜1

M＞66～44～22～11～0

J＞0.80.8～0.50.5～0.30.3～0.1＜0.1

根據浮游生物多樣性指數水質評價標準（見表1），綜合三種多樣性指數結果，可判斷出北洛河流域豐水期水環境質量屬于輕度污染-中度污染，但個別采樣點位水質屬于中污染-重污染。

3討論

調查發現，北洛河流域浮游動物群落結構在種類組成上主要以輪蟲為主，輪蟲有41個種，占種類數的83.67%。這一調查結果與國內其他流水性河流浮游動物群落的組成較相似，符合典型河流型浮游動物群落組成［12］。從現存量來看，輪蟲密度為719.9 ind./L，占中密度的95.98%，在生物量上輪蟲和原生動物的百分比有所下降，而枝角類和橈足類的比重有所上升，這要是因為輪蟲和原生動物體型較小，它們的相對濕重較體型較大的枝角類和橈族類偏低。

根據浮游生物多樣性指數水質評價標準評價北洛河流域水質發現，多樣性指數顯示水環境質量為β-中污染，而豐富度指數顯示水環境質量為α-中污染，均勻度指數顯示水質為輕度污染。Margalef物種豐富度指數（M）是表示群落種類的豐富程度，一般情況下，在健康的環境種類豐富度高，在受污染環境中種類豐富度

摘要：采用高效液相色譜法測定水產品中孔雀石綠的殘留量，參考GB/T 20361-2006的方法，將前處理步驟部分進行了優化，將樣品前處理的勻漿提取改為樣品渦動和離心；增加50 mL實驗用水，去掉二次萃取乙腈，不用過濾膜過濾直接上機進行測定。結果表明：經添加回收實驗，回收率在80%左右，本方法操作簡便，消除了乳化現象，提高回收率，偏差小。

關鍵詞：水產品；孔雀石綠；前處理；優化

水產品營養豐富，味道鮮美，深受人們喜愛。近年來水產養殖業迅猛發展，水產品中藥物殘留對人類健康的危害已成為當今突出的食品安全問題［1］，許多商者為了增加收益，在水產品中添加孔雀石綠藥物對其新鮮度和完好性進行防御。孔雀石綠是帶有金屬光澤的綠色結晶體，可用于治理魚類、魚卵寄生蟲、真菌或細菌感染，在養殖與運輸中被常常用到，是廉價、療效好的藥物，然而其具有難代謝、殘留時間長、高毒性、高殘留、可致癌、致畸形等多種副作用，危害人們的身體健康，被許多國家紛紛禁止使用。為了防止濫用孔雀石綠，許多國家也都制定了相應的法規措施及檢測標準。目前對孔雀石綠的檢測主要有高效液相色譜法，有的省部級單位開始用液質聯用檢測儀，雖然有較低的檢測限，但是儀器價格昂貴，技術要求較高。而且，我們在采用國標GB/T20361-2006的熒光檢測方法實驗過程中發現了一些問題，為提高檢測工作效率，保障檢測結果的準確性、可靠性，我們在此基礎上進行了部分改進。經過研究能滿足水產品孔雀石綠殘留量測定的要求，可為保護廣大消費者的身體健康、為農業執法提供重要的技術保障。

1實驗部分

1.1儀器與設備

島津LC20A液相色譜儀，熒光檢測器；高速離心機：TGL-20M；旋轉蒸發儀。

1.2色譜條件

參照GB/T 20361-2006［2］的色譜條件。

1.3樣品制備

參照GB/T 20361-2006［2］的樣品提取、萃取、凈化等步驟，結合優化步驟進行處理操作，符合檢測標準要求。

2結果與討論

實驗結果以色譜圖中保留時間定性，外標法定量。

2.1樣品提取改進

本方法將GB/T 20361-2006中的1 000 r/min勻漿提取30 s改為加標靜置10 min，防止用勻漿機勻漿增加加標損失，影響回收率，并用3 000 r/min渦動2 min，4 000 r/min離心3 min，使孔雀石綠提取完全，增加它的溶出效果，從而增加實驗的回收率效果。

2.2樣品萃取改進

因GB/T 20361-2006方法萃取乳化現象嚴重，第二次萃取分層不明顯，因此第一次萃取加入50 mL水；由于乙腈對水的溶解度較大，第二次將5 mL乙腈去掉， 不用離心第二次分層效果非常明顯，縮短了時間，提取分離效果也提高了。

2.3樣品過濾膜改進

由于市面上的濾膜質量參差不齊，有時出現一些濾膜的雜峰［3］，干擾出峰，使得譜圖不美觀，所以本方法將過柱提取液直接于刻度管中定容上機測定，節約了成本，提高了效率。

2.4標準曲線及加標回收情況

以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標做標準曲線，在0.1～500 ng/mL線性范圍內良好，線性范圍良好。標準品譜圖見圖1。

圖1孔雀石綠標準譜圖

取大菱鲆7份樣品，分別按加入1 mL 500 ng/mL；2 mL 500 ng/mL標準工作液，進行加標回收實驗，每個溶度重復3次，另外一份為空白對照，按照改進的方法進行測定，結果如表1 。

表1大菱鲆加標回收結果

添加物質

添加量/ng·g-1

樣品平均含量/ng·g-1

平均回收率/%

RSD/%

孔雀石綠

100200

87.5

178.2

87.5

89.1

2.2

1.8

3結論

本實驗在GB/T 20361-2006的基礎上進行了改進。將樣品前處理的勻漿提取改為樣品渦動和離心；提高了目標物的溶出效果，減少了勻漿帶來的損失，提高了回收率，同時在萃取步驟增加50 mL實驗用水，去掉5 mL乙腈，減少了試劑的使用，防止了乳化現象的出現，增加了萃取分層的效果；實驗最后不用過濾膜過濾直接上機進行測定，節省了消耗品的成本，也避免了雜峰的干擾。結果表明，經改進的方法用于檢測水產品中的孔雀石綠成分，簡便、偏差小、提高了回收率、提高了工作效率。而且通過從事檢測工作不同工作年限的試驗人員的多次比對，回收率也能達到80%左右，說明改進后的方法適用于水產品中的孔雀石綠成分殘留量的檢測。

參考文獻：

［1］

鄭斌.水產品中幾種常用藥物殘留的液相色譜檢測方法研究［D］.青島：中國海洋大學，2008

［2］ GB/T 20361-2006.水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法［S］.北京：中國標準出版社，2006

［3］ 曲娜.水產品中孔雀石綠檢測方法研究與改進［J］.農業開發與裝備；2013（03）：125+122

1.2色譜條件

參照GB/T 20361-2006［2］的色譜條件。

1.3樣品制備

參照GB/T 20361-2006［2］的樣品提取、萃取、凈化等步驟，結合優化步驟進行處理操作，符合檢測標準要求。

2結果與討論

實驗結果以色譜圖中保留時間定性，外標法定量。

2.1樣品提取改進

本方法將GB/T 20361-2006中的1 000 r/min勻漿提取30 s改為加標靜置10 min，防止用勻漿機勻漿增加加標損失，影響回收率，并用3 000 r/min渦動2 min，4 000 r/min離心3 min，使孔雀石綠提取完全，增加它的溶出效果，從而增加實驗的回收率效果。

2.2樣品萃取改進

因GB/T 20361-2006方法萃取乳化現象嚴重，第二次萃取分層不明顯，因此第一次萃取加入50 mL水；由于乙腈對水的溶解度較大，第二次將5 mL乙腈去掉， 不用離心第二次分層效果非常明顯，縮短了時間，提取分離效果也提高了。

2.3樣品過濾膜改進

由于市面上的濾膜質量參差不齊，有時出現一些濾膜的雜峰［3］，干擾出峰，使得譜圖不美觀，所以本方法將過柱提取液直接于刻度管中定容上機測定，節約了成本，提高了效率。

2.4標準曲線及加標回收情況

以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標做標準曲線，在0.1～500 ng/mL線性范圍內良好，線性范圍良好。標準品譜圖見圖1。

圖1孔雀石綠標準譜圖

取大菱鲆7份樣品，分別按加入1 mL 500 ng/mL；2 mL 500 ng/mL標準工作液，進行加標回收實驗，每個溶度重復3次，另外一份為空白對照，按照改進的方法進行測定，結果如表1 。

表1大菱鲆加標回收結果

添加物質

添加量/ng·g-1

樣品平均含量/ng·g-1

平均回收率/%

RSD/%

孔雀石綠

100200

87.5

178.2

87.5

89.1

2.2

1.8

3結論

本實驗在GB/T 20361-2006的基礎上進行了改進。將樣品前處理的勻漿提取改為樣品渦動和離心；提高了目標物的溶出效果，減少了勻漿帶來的損失，提高了回收率，同時在萃取步驟增加50 mL實驗用水，去掉5 mL乙腈，減少了試劑的使用，防止了乳化現象的出現，增加了萃取分層的效果；實驗最后不用過濾膜過濾直接上機進行測定，節省了消耗品的成本，也避免了雜峰的干擾。結果表明，經改進的方法用于檢測水產品中的孔雀石綠成分，簡便、偏差小、提高了回收率、提高了工作效率。而且通過從事檢測工作不同工作年限的試驗人員的多次比對，回收率也能達到80%左右，說明改進后的方法適用于水產品中的孔雀石綠成分殘留量的檢測。

參考文獻：

［1］

鄭斌.水產品中幾種常用藥物殘留的液相色譜檢測方法研究［D］.青島：中國海洋大學，2008

［2］ GB/T 20361-2006.水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法［S］.北京：中國標準出版社，2006

［3］ 曲娜.水產品中孔雀石綠檢測方法研究與改進［J］.農業開發與裝備；2013（03）：125+122

1.2色譜條件

參照GB/T 20361-2006［2］的色譜條件。

1.3樣品制備

參照GB/T 20361-2006［2］的樣品提取、萃取、凈化等步驟，結合優化步驟進行處理操作，符合檢測標準要求。

2結果與討論

實驗結果以色譜圖中保留時間定性，外標法定量。

2.1樣品提取改進

本方法將GB/T 20361-2006中的1 000 r/min勻漿提取30 s改為加標靜置10 min，防止用勻漿機勻漿增加加標損失，影響回收率，并用3 000 r/min渦動2 min，4 000 r/min離心3 min，使孔雀石綠提取完全，增加它的溶出效果，從而增加實驗的回收率效果。

2.2樣品萃取改進

因GB/T 20361-2006方法萃取乳化現象嚴重，第二次萃取分層不明顯，因此第一次萃取加入50 mL水；由于乙腈對水的溶解度較大，第二次將5 mL乙腈去掉， 不用離心第二次分層效果非常明顯，縮短了時間，提取分離效果也提高了。

2.3樣品過濾膜改進

由于市面上的濾膜質量參差不齊，有時出現一些濾膜的雜峰［3］，干擾出峰，使得譜圖不美觀，所以本方法將過柱提取液直接于刻度管中定容上機測定，節約了成本，提高了效率。

2.4標準曲線及加標回收情況

以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標做標準曲線，在0.1～500 ng/mL線性范圍內良好，線性范圍良好。標準品譜圖見圖1。

圖1孔雀石綠標準譜圖

取大菱鲆7份樣品，分別按加入1 mL 500 ng/mL；2 mL 500 ng/mL標準工作液，進行加標回收實驗，每個溶度重復3次，另外一份為空白對照，按照改進的方法進行測定，結果如表1 。

表1大菱鲆加標回收結果

添加物質

添加量/ng·g-1

樣品平均含量/ng·g-1

平均回收率/%

RSD/%

孔雀石綠

100200

87.5

178.2

87.5

89.1

2.2

1.8

3結論

本實驗在GB/T 20361-2006的基礎上進行了改進。將樣品前處理的勻漿提取改為樣品渦動和離心；提高了目標物的溶出效果，減少了勻漿帶來的損失，提高了回收率，同時在萃取步驟增加50 mL實驗用水，去掉5 mL乙腈，減少了試劑的使用，防止了乳化現象的出現，增加了萃取分層的效果；實驗最后不用過濾膜過濾直接上機進行測定，節省了消耗品的成本，也避免了雜峰的干擾。結果表明，經改進的方法用于檢測水產品中的孔雀石綠成分，簡便、偏差小、提高了回收率、提高了工作效率。而且通過從事檢測工作不同工作年限的試驗人員的多次比對，回收率也能達到80%左右，說明改進后的方法適用于水產品中的孔雀石綠成分殘留量的檢測。

參考文獻：

［1］

鄭斌.水產品中幾種常用藥物殘留的液相色譜檢測方法研究［D］.青島：中國海洋大學，2008

［2］ GB/T 20361-2006.水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法［S］.北京：中國標準出版社，2006

［3］ 曲娜.水產品中孔雀石綠檢測方法研究與改進［J］.農業開發與裝備；2013（03）：125+122