利用高效液相色譜法同時測定土曲霉發酵液中衣康酸及殘糖

劉 蘭，黃筱萍，熊大維，黃國昌，張 婷

(江西省科學院微生物研究所，330096，南昌)

利用高效液相色譜法同時測定土曲霉發酵液中衣康酸及殘糖

劉 蘭，黃筱萍，熊大維，黃國昌，張 婷

(江西省科學院微生物研究所，330096，南昌)

建立了高效液相色譜(HPLC)快速測定土曲霉發酵液中衣康酸及殘糖的分析方法。使用TOSOH Tskgel oApak-A色譜柱，以0.75 mmol/L H2SO4為流動相，在柱溫45 ℃，流速1.0 mL/min的條件下，采用示差折光檢測器進行檢測。結果表明，該方法在20 min內可實現發酵液中衣康酸和葡萄糖的完全分離與定量。衣康酸在0～10.056 g/L范圍內的線性關系良好，相關系數為0.999 9，相對標準偏差(n=6)為0.33%，加標回收率100.88%～102.74%。葡萄糖在0～6.016 g/L范圍內的線性關系良好，相關系數為0.999 9，相對標準偏差(n=6)為0.12%，加標回收率101.26%～103.12%。該法適用于土黃霉發酵液中衣康酸和葡萄糖的快速、高效分離和定量測定。

高效液相色譜；衣康酸；葡萄糖；土曲霉；發酵液

0 引言

衣康酸(Itaconic acid)學名亞甲基丁二酸、甲叉丁二酸、亞甲基琥珀酸[1]，是世界上5大有機酸之一。由于其含不飽和雙鍵，具有活潑的化學性質，能進行各種加成反應，酯化反應和聚合反應，是化學合成和化工生產的重要工業原料，在化纖、合成樹脂、塑料、橡膠、醫藥、表面活性劑以及食品領域具有廣泛的應用，隨著衣康酸具有的獨特性能被認識及應用范圍的迅速擴大，衣康酸的生產技術也在不斷進步[2]。

發酵法生產衣康酸由于原料易得，工藝技術成熟，是目前國內外工業生產一致采用的方法[4]。測定衣康酸發酵液中殘糖及衣康酸的變化，對揭示代謝途徑以及控制發酵過程，從而優化發酵工藝條件意義重大。目前，衣康酸發酵液中的衣康酸采用Friedkin碘量法測定，還原糖采用DNS法(3,5-二硝基水楊酸比色法)或菲林試劑滴定法測定[3-5]。由于采用多種分析手段分析發酵液，過程繁瑣費時。因此針對衣康酸發酵工藝建立快速、準確地同時測定衣康酸和殘糖的分析方法對于衣康酸發酵技術的發展具有重要的意義。白冬梅等使用反相高效液相色譜法同時分析了發酵液中有機酸和葡萄糖[6-7]。馬瑞等使用離子排斥液相色譜法同時分析了6種有機酸和3種糖類物質[8]。

本研究采用HPLC法，利用TOSOH Tskgel oApak-A色譜柱，以示差折光檢測器(RID)檢測，建立了同時檢測土曲霉發酵液中葡萄糖和衣康酸的方法。該方法可以較準確地測定衣康酸發酵過程中糖的消耗量及衣康酸代謝產物的生成量，這對于控制發酵過程，優化發酵工藝條件及操作參數，從而提高衣康酸產量具有重要的理論和現實指導意義。

1 實驗部分

1.1儀器與試劑

日本島津(Shimadzu)LC-20A高效液相色譜儀(配示差折光檢測器，島津LC電腦工作站)；Practum224-1CN電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；FDY0501-UV-P超純水設備(青島富勒科技有限公司)；H2500R-2高速冷凍離心機(湖南湘儀)。

衣康酸(純度為99%；CAS號97-65-4)；葡萄糖(純度為99.5%；CAS號：55-99-7)。

1.2色譜條件

色譜柱：TOSOH Tskgel oApak-A(300 mm×7.8mm，5 μm)；流動相：0.75 mmol/L H2SO4；流速：1.0 mL/min；柱溫：45 ℃；檢測器：RID；進樣量：10 μL；外標法定量。

1.3樣品溶液配制

1.3.1 標準溶液配制 準確稱取烘干至恒重的分析純葡萄糖5.013 4 g，用超純水溶解，定容至100 mL，配成50.13 4 g/L的標準溶液，作為儲備液。然后分別從儲備液中精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL至50 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為1.002 7 g/L、2.005 4 g/L、3.008 0 g/L、4.010 7 g/L、5.013 4 g/L、6.016 1 g/L的標準工作溶液。

準確稱取衣康酸標準品2.031 5 g(純度為99%)，用超純水溶解，定容至100 mL，配成20.112 g/L的標準溶液，作為儲備液。然后分別從儲備液中精密量取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL至10 mL容量瓶中, 加超純水定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為2.0112 g/L、4.022 4 g/L、6.033 6 g/L、8.044 8 g/L、10.056 0 g/L的標準工作溶液。

1.3.2 混合標準溶液配制 稱取衣康酸0.710 6 g及葡萄糖0.505 9 g，用超純水溶解至100 mL，配制含衣康酸和葡萄糖標準物質的混合溶液，2組份的質量濃度見表1。

表1 衣康酸及葡萄糖混合標準溶液的組成

1.4定性和定量

在相同色譜條件下，將樣品色譜圖與衣康酸以及葡萄糖標準液色譜圖對照，根據保留時間確定樣品中各組分的色譜峰；在標樣與樣品進樣量相同的情況下，應用外標法定量，計算樣品中各組分的含量。

2 結果與討論

2.1標準物質的確定

在1.2節的色譜條件下分別測定衣康酸和葡萄糖標準溶液，確定各組分的保留時間(衣康酸的色譜圖見圖1；葡萄糖的色譜圖見圖2)；再測定混合標準溶液，得到混合標準溶液的色譜圖(見圖3)，從圖3可以看出衣康酸和葡萄糖的分離效果很好，出峰順序為葡萄糖、衣康酸。

圖1 衣康酸標準溶液色譜圖

圖2 葡萄糖標準溶液色譜圖

圖3 葡萄糖和衣康酸混合標準溶液色譜圖

2.2色譜條件的選擇

本實驗根據色譜柱的特性對分析溫度及流速進行了考察，確定最佳分析條件。

2.2.1 柱溫的選擇 分別考察了柱溫為35 ℃、40 ℃、45 ℃時的分離情況，從圖4中可看出柱溫對葡萄糖和衣康酸的分離度影響不大，衣康酸保留時間稍提前，且柱壓降低。考慮柱壓低可延長分析柱的的壽命，本實驗將柱溫定為45 ℃。

2.2.2 流速的選擇 流動相的流速對液相色譜的分離有影響，流速分別設定為0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，進行考察。從圖4中可看出，隨著流速的增加，保留時間都有提前，但柱壓增大，峰面積減小，說明靈敏度下降，綜合考慮，本實驗選擇流速為1.0 mL/min。

圖4 柱溫及流速對葡萄糖和衣康酸混合溶液保留時間的影響

2.3標準工作曲線的制作

將1.3.1配制的葡萄糖及衣康酸標準工作溶液，按10 μL進樣量分別進行分析，記錄各質量濃度得到的峰面積A，將各峰面積A與對應的質量濃度C(g/L)進行線性回歸，結果見表2。

表2 衣康酸和葡萄糖的保留時間、線性關系

2.4重復性(精密度)和回收率(準確度)

2.4.1 重復性(精密度)實驗 將搖瓶發酵一定時間的發酵液進行適當稀釋，作為試驗樣品，按色譜條件，進樣分析得色譜圖5，可見葡萄糖出峰時間9.130 min，衣康酸出峰時間18.332 min，兩者分離效果好，其它雜質低。連續進樣6次，測得結果見表3，葡萄糖和衣康酸的相對標準偏差為0.11%、0.33%。

圖5 土曲霉搖瓶發酵液色譜圖

表3 土曲霉發酵液的重復性試驗結果

2.4.2 加標回收率(準確度)實驗 加標回收率的測定，是對所建立分析方法適用性及系統誤差的檢驗，也是分析質量控制的一種手段。本實驗以稀釋一定倍數的發酵液作為試驗樣品，平行取樣6次進行2個水平的加標回收試驗，結果見表4，得到葡萄糖和衣康酸的加標回收率在100.88%～103.12%之間。

表4土曲霉發酵液中葡萄糖和衣康酸的加標回收率(n=6)

CompoundBackground/g·L-1Added/g·L-1Found/g·L-1Recovery/%Glucose2．46711．50513．01024．09615．5463103．12101．26Itaconicacid3．0643．01686．03366．24769．1778102．74100．88

3 結論

1)采用HPLC對土曲霉發酵液中衣康酸及葡萄糖含量進行檢測，確定了最佳色譜條件：TOSOH Tskgel oApak-A色譜柱，示差檢測器(RID)，流動相0.75 mmol/L H2SO4，流速1.0 mL/min，柱溫45 ℃。

2)該方法前處理簡單、精密度好、靈敏度高，比常規化學滴定法省時、省力，為衣康酸發酵工藝改進的研究及適時監控提供了方便。

[1] 劉建軍,姜魯燕,李丕武,等.衣康酸的性質、生產及應用[J].山東科學,2002,15(3):38-42.

[2]何敏超,張宇,許敬亮,等.衣康酸產業的現狀和展望[J].中國釀造,2012,31(11):8-11.

[3]賈士儒,王明霞,陳貴斌,等.衣康酸發酵工藝的初步研究[J].食品與發酵工業,1999,25(2):39-42.

[4]劉建軍,姜魯燕,李丕武,等.發酵法生產衣康酸技術的研究-衣康酸發酵工藝條件的研究(Ⅱ)[J].食品與發酵工業,2003,29(4):27-32.

[5]徐建春,李霞,王海英.發酵法生產衣康酸-高產菌株的選育[J].發酵科技通訊,2008,37(1):30-32.

[6]白冬梅,杜國民,沈菲,等.反相HPLC同時測定產琥珀酸放線桿菌發酵液中的有機酸與葡萄糖[J].分析試驗室,2004,23(3):15-18.

[7]白冬梅,趙學明,胡宗定,等.反相HPLC雙控檢測器法同時測定米根霉乳酸發酵液中的有機酸與葡萄糖[J].食品與發酵工業,2000,27(11):13-17.

[8]馬瑞,歐陽嘉,李鑫,等.高效液相色譜法同時測定生物質乳酸發酵液中有機酸及糖類化合物[J].色譜,2012,30(1):62-66.

SimultaneousdeterminationofItaconicAcidandSaccharidesinItaconicAcidFermentationBrothofAspergillusterreusbyHighPerformanceLiquidChromatography

LIU Lan,HUANG Xiaoping,XIONG Dawei,HUANG Guochang,ZHANG Ting

(Jiangxi Academy of Science. Institute of Microbiology,330096,Nanchang,PRC)

A high performance liquid chromatographic method for rapid determination of itaconic acid and saccharides in itaconic acid fermentation broth ofAspergillusterreuswas developed.A TOSOH Tskgel oApak-A column was used at 45 ℃ and the mobile phase was 0.75 mmol/L H2SO4at a flow rate of 1.0 mL/min.Under the optimized conditions.The itaconic acid and glucose in samples were determined and completely separated within 20 min by a refractive index detector (RID).The Linear correlation coefficient for itaconic acid was 0.999 9 in the range of 0～10.056 g/L.The Linear correlation coefficient for glucose was 0.999 9 in the range of 0～6.016 g/L.The relative standard deviation (RSD,n=6) of itaconic acid and glucose was 0.33% and 0.15% respectively.The recovery rate was 100.88%～102.74% and of 101.26%～103.12% separately.This method established is proved to be fast and accurate for the quantitative analysis of the itaconic acid and glucose in fermentation broth ofAspergillusterreus.

high performance liquid chromatography(HPLC);itaconic acid;glucose;Aspergillusterreus;fermentation broth

2014-10-13;

2014-11-17

劉 蘭(1969-)，女，本科，研究方向：有機酸發酵。

10.13990/j.issn1001-3679.2014.06.027

O658

A

1001-3679(2014)06-0865-04