改良酚/氯仿法結合miniSTR分型技術檢驗陳舊骨痕量DNA

徐 凱，徐國昌 ，張 玥，任 甫

·法醫學·

改良酚/氯仿法結合miniSTR分型技術檢驗陳舊骨痕量DNA

徐 凱1，徐國昌2，張 玥3，任 甫4

目的建立5個miniSTR基因座的復合擴增系統，提高STR基因座對陳舊骨檢材的個體識別效能。方法新設5個STR基因座的引物，分別用FAM、TAMRA、TET標記D3S3053、D18S853、D12ATA63、D6S474、D9S1122，通過PCR擴增，利用ABI3100xL遺傳分析儀進行片段長度分析，對84份河南漢族無關個體血樣，以及25例陳舊骨檢材進行檢測。結果5個基因座均得到有效擴增，在河南漢族人群中5個miniSTR基因座個體識別能力DP為0.8768～0.9623，雜合度H為0.7454～0.8934，多態信息含量PIC為0.7145～0.8214。5個miniSTR基因座總DP值為0.999 996 72。用Identifil試劑盒及miniSTR技術對25份陳舊骨檢材的位點檢出率分別為60.25%和84.80%。結論上述5個miniSTR基因座在河南漢族人群中等位基因分布較好，個體識別能力高，適用于個人識別和親權鑒定，同時為陳舊骨痕量DNA樣本分型提供了一種新的檢測方法。

miniSTR；遺傳多態性；陳舊骨

由于PCR擴增高度多態性的STR基因座是法醫學領域目前用于親子鑒定和個人識別的主流技術，在時間較久的埋尸、溺水等案件和考古人類學中，機體的軟組織大部分被毀和降解，無法應用常規檢材進行個體識別。因此，不斷尋找新的STR基因座仍然非常重要。骨骼作為一類特殊的檢材，相對于人體的其他組織抗腐敗能力強且保存時間長[1]，故其在上述系列案件和研究中對于個體識別起到越來越重要的作用。陳舊骨DNA的檢出率受時間、環境等因素的影響，時間越久遠、環境越極端，DNA檢出成功率越低，甚至失去了檢材的應用價值。MiniSTR技術設計的引物更靠近核心重復序列，因此產生的STR等位基因片斷長度更短，分型成功率獲得很大提高[2]。MiniSTR 技術被證明是一種有效的從微量以及降解檢材中獲得遺傳信息的方法，在提高降解檢材分型成功率方面具有明顯優勢[3-4]。本研究根據Hill[5]等最新研究進展選擇D3S3053等5個新的miniSTR位點研究其多態性，且成功應用于陳舊骨檢材的個體識別，為陳舊骨等降解檢材的個體識別提供了一種新的方法。

1 材料和方法

1.1 研究對象84例河南地區無關個體血樣，日常受理案件中經Identifiler試劑盒分型不理想的陳舊骨(3～10 a室溫保存)檢材25份。

1.2 DNA提取無關血樣采用Chelex法提取DNA。陳舊骨檢材采用改良酚/氯仿法提取DNA。陳舊骨樣本DNA提取主要步驟為：①生物冷凍研磨機研磨，液氮環境，設置預冷15 min，研磨2次，每次10 min；②pH=8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)對骨粉脫鈣，適時更換脫鈣液，每次更換時均要離心，50℃水浴；③飽和酚配以三氯甲烷：異戊醇(24∶1)混液，兩者體積比為4.5∶1，之后用三氯甲烷∶異戊醇混液離心；④正丁醇600 μL，混勻，離心后棄上液。乙醚600 μL，混勻，離心后棄上液，置于50℃，數分鐘，揮發完全；⑤Buffer PB5 mL，RNA1 μL，冷凍離心后取上液，通過硅膜管，每次約700 μL，離心后棄下液。PB700 μL再洗1次；PE洗液700 μL，混勻，離心，重復3次，離心8 000 r/min，8 min；52℃10 min EB30 μl，加入管底中央區，52℃ 5 min，冷凍離心13 000 r/min，8 min。

1.3 PCR擴增5個miniSTR基因座的引物序列見表1，擴增體系在GeneAmp-9700中進行，DNA濃度1 ng/μL，1 GeneAmp-PCR Gold buffer，2 μM MgCl2，0.2 μM引物，1U AmpliTaq Gold DNA 聚合酶，0.16 mg/mL牛血清蛋白。總反應體積為10 μM，PCR 擴增條件為：預變性10 min 95℃，變性1 min 94℃，復性1 min 59℃，延伸1 min 72℃，復延伸45 min 60℃，最后保存在25℃。共28個循環。

表1 5個miniSTR基因座及引物序列

1.4 等位基因階梯的制備篩選出所有等位基因片段的DNA，調整各DNA終濃度達到一致。取等體積混合，擴增混合物，其產物作為allelic ladder。把所測每個樣本模板等體積混合，每個位點單獨擴增，擴增條件如上所述。擴增完之后取每個位點的擴增產物1 μL加1 mL水稀釋混合，在上述條件下再次擴增，經15次循環，在60℃下保存4 h。

1.5 電泳檢測擴增產物1.2 μL，Hi-Di 9 μL，GS500LIZ 0.4 μL，混勻變性，于ABI PRISMI3130xL型遺傳分析儀上進行檢測。Gene mapper 3.2軟件對電泳結果進行分析。

2 結果

2.1 5個miniSTR基因座均得到有效擴增等位基因分布頻率見表2。期望雜合度(H)、多態信息含量(PIC)、個體識別能力(DP)遺傳學參數見表3。

表2 河南漢族人群5個miniSTR基因座等位基因頻率分布

A：等位基因；F：基因頻率。

表3 河南漢族人群5個miniSTR基因座的H、PIC、DP值

Loci：STR基因位點；H：親合度；PIC：多態信息含量；DP：個體識別能力。

2.2 陳舊骨檢材的檢測情況25例陳舊骨檢材用Identifiler(16位點)試劑盒檢測時，有1例幾乎沒有獲得目的片段，檢出率50%(含)以下的有9例，總位點檢出率為241/400=60.25%。經5個miniSTR基因座檢測，有15例擴增完全顯示，其中1例無擴增產物，總位點檢出率為106/125=84.80%。25例檢材的檢測情況及統計結果見表4。

表4 Identifiler試劑盒(A)和5個miniSTR基因座(B)檢測結果比較 例(%)

3 討論

STR是一類廣泛存在于真核生物基因組中的DNA重復序列。STR以核心重復單位數目的變化構成遺傳多態性，已廣泛應用于遺傳病的診斷和法醫學的鑒定。針對CODIS系統所設計的miniSTR 基因座已有報道，但并非所有CODIS 基因座均適合重新設計miniSTR 引物，且有些基因座在中國人群的多態性較低，僅用現有試劑盒檢驗難以滿足特殊案件個體識別及親權鑒定的需要[6]。馬威[7]等人用D10S1248、D14S1434 和D22S1045 3個miniSTR 基因座對東北漢族群體的141 名隨機個體樣本進行遺傳多態性研究，認為3 個基因座在東北漢族均具有高度的遺傳多態性，在群體遺傳學和法醫學研究中有一定的應用價值。

在本研究選擇的5個位點經Hard-Weinberg平衡檢驗，均為P>0.05，說明5個位點都符合Hard-Weinberg平衡。5個基因座的聯合DP值為0.999 996 72，均屬于多態性較好的遺傳標記。個人識別能力為0.8768～0.9623，提示為能夠適合法醫應用的遺傳標記。與目前廣泛使用的常規商品化試劑盒相比，5個miniSTR能達到相同的個體識別力。在法醫DNA檢驗中，STR技術雖已廣泛用于個人識別和親權鑒定方面，但是對于法醫學中一些微量以及降解的檢材，STR技術并不能成功地得出結論，經常會出現“優勢擴增”或者“無效擴增”。miniSTR技術在設計引物時，使其結合在更靠近核心重復序列的側翼序列，PCR擴增的產物就會比STR基因座更短一些[8-9]。MiniSTR的引物位置決定PCR產物的大小，但與原來STR基因座相比，核心序列的重復次數卻沒有改變。STR基因座擴增成功率與等位基因長度成反比，當樣本DNA降解到100 bp左右時，用常規試劑盒檢測擴增效果常常不盡理想。

不同情況的陳舊骨骼存留的STR 基因座檢出結果會有所不同，個體識別能力也不同。分析原因，主要是由于STR 基因座片斷長度的差別，使不同的基因座抗降解的能力有所差異，從而使不同基因座在同一檢測條件下檢出率呈現差異。本研究選用擴增片段很短的miniSTR基因座(70～140) bp對Identifiler試劑盒擴增不成功的25例陳舊骨檢材再次進行miniSTR基因分型，結果大部分得到了清晰的等位基因條帶，顯示miniSTR技術檢測小片段DNA的成功率比一般商品化試劑盒高，有助于法醫學上降解檢材的檢測。

總之，陳舊骨的個體識別目前尚缺乏統一的標準，陳舊骨基因水平的檢測需要更準確、簡單、快速的檢測指標。MiniSTR作為STR檢驗的一個新的發展方向，是商品化STR試劑盒的重要補充，可以更好地解決法醫學實踐中遇到的降解檢材痕量DNA分型的難題，能更好地為法庭科學服務。

[1]張付瑤,王傳海,杜舟,等.DNA Typer TM15與Identifiler TM試劑盒對陳舊骨骼、牙齒和指甲樣本檢驗結果的比較分析[J].中國實驗診斷學,2012,16(9):1580-1582.

[2]徐國昌,任甫,劉海東.遼寧漢族人群5個miniSTR基因座遺傳多態性[J].中國法醫學雜志,2012,27(3):157-158.

[3]Yong RY,Gan LS,Coble MD,et al.Allele frequencies of six miniSTR loci of three ethnic populations in Singapore[J].Forensic Sci Int,2007,166(2-3):240-243.

[4]Thomsen AR,Hallenberg C,Simonsen BT,et al.A report of the 2002～2008 paternity testing workshops of the English speaking working group of the International Society for Forensic Genetics[J].Forensic Sci Int Genet.2009,3(4):214-221.

[5]Hill CR,Kline MC,Coble MD,et al.Characterization of 26 miniSTR loci for improved analysis of degraded DNA samples[J].J Forensic Sci,2008,53(1):73-80.

[6]劉超,馮冬亮,劉長暉.熒光標記8個miniSTR及Amelogenin復合擴增體系的建立[J].中國法醫學雜志,2011,26(2):99-103.

[7]馬威,李巖,徐飛.中國東北漢族群體3個MiniSTR基因座的遺傳多態性研究[J].人類學學報,2010,29(4):437-444.

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AnalysisonTraceDNAfromObsoleteBonesbyPhenol-chloroformCoupledwithMiniSTRTechnicalMethod

XU Kai，XU Guo-chang,ZHANG Yue,et al

(Henan Province People’s Procuratorate,Zhengzhou 453000,China)

ObjectiveTo establish five loci multiplex amplification miniSTR systems,and to improve forensic detection performance of the obsolete bone samples with the STR loci.MethodsThe new five STR loci(D3S3053,D18S853,D12ATA63,D6S474,D9S1122) primers were designed and marked by FAM,TAMRA,TET,amplified by PCR and analysized using the ABI3100xL genetic analyzer for fragment length analysis.84 Henan Han Nationality blood samples of unrelated individuals,and 25 cases of obsolete bone samples were collected for testing.Results5 loci were effectively amplified,the 5 miniSTR recognition rate(DP) of individual loci in the Han Nationality population was 0.8768～0.9623,the heterozygosity (H) was 0.7454～0.8934,and the polymorphism information content (PIC) is 0.7145～0.8214.The total 5 miniSTR loci DP was 0.999 996 72.The detection rate of remaining genetic locus of the 25 obsolete bones was 84.80% by Identifiler kit,and 60.25% by miniSTR method.ConclusionThe five miniSTR loci in Han Nationality population in Henan Province is better distributed and easily recognized as a individual identification and paternity testing,and provides a new detection method for DNA samples typing of obsolete bones.

miniSTR; genetic polymorphisms; obsolete bones

河南省科技廳基礎與前沿技術研究項目(132300410088) 遼寧省百千萬人才工程培養經費資助項目(2010921042)

2013-11-20

1.河南省人民檢察院，河南鄭州 453000 2.南陽理工學院生物人類學研究所，河南南陽 473004 3.重慶市公安局，重慶 400000 4.遼寧醫學院人類學研究所，遼寧錦州 121000

徐凱(1974-)，男，河南駐馬店人，法醫師，從事法醫病理學研究。

徐國昌，碩士，副教授，E-mail:xuguoch@163.com

Q987

A

1672-688X(2014)01-0057-04