Design and Implementation for Diarrheic Shellfish Poison Detection Based on Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing*

SU Kaiqi，ZOU Ling，WANG Qin，LI Hongbo，CAO Duanxi，ZOU Qichao，ZHOU Jie，HU Ning，WANG Ping

(Biosensor National Laboratory，Key Laboratory of Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

Design and Implementation for Diarrheic Shellfish Poison Detection Based on Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing*

SU Kaiqi，ZOU Ling，WANG Qin，LI Hongbo，CAO Duanxi，ZOU Qichao，ZHOU Jie，HU Ning，WANG Ping*

(Biosensor National Laboratory，Key Laboratory of Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

A novel system for fast poison detection based on electrical cell-substrate impedance sensing was proposed and fabricated for resolving the problems of marine diarrheic shellfish poison detection.Comparing with tranditional methods，the system has the performance of simple operation，high consistency and high throughput.In this study，the design of system hardware and software were introduced and then its performance was tested.Finally，toxin detection experiments with Neuro-2a，DSP and OA were used to certify the availability of system.The results showed that the system had some attributes such as fast，long-time monitoring，no invasion and high throughput and applied a new detection platform for DSP of marine productions.

electrical cell-substrate impedance sensing，diarrheic shellfish poison，okadaic acid，poison detection system

海洋水產品毒素是一類由浮游生物產生的非蛋白質小分子化合物。雙殼類軟體動物或其他貝類動物通過濾食而將這些毒素積存在體內［1-4］。人們由于食用這些水產品而中毒甚至死亡。總的來說，海洋水產品毒素可以根據所引發的癥狀歸為7類:腹瀉性貝類毒素(DSP)，麻痹性貝類毒素(PSP)，記憶缺失性貝類毒素(ASP)，神經性貝類毒素(NSP)，氨代螺旋酸貝類毒素(AZP)，魚肉毒素(CFP)和河豚魚毒素［5］。DSP中毒癥狀主要包括惡心、腹瀉、嘔吐和腹痛等［6］。DSP主要成分為大田軟海綿酸(OA)及其酸性派生物毒素(DTXs)［5，7］。OA在1981年首次從大田軟海綿中分離出來因此而得名［8］。研究報道OA及其衍生物會抑制具有蛋白質脫磷酸作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶。目前報道的由DSP引起的中毒事件遍及全球，包括日本、歐洲、美國和中國等［9-11］。根據CE No.853/2004歐盟設置OA含量的標準為不超過160 μg/Kg［12］。因此，如何檢測DSP是一個急需解決的熱點問題。

目前海洋水產品毒素檢測技術包括小白鼠生物法(MBA)、細胞檢測、免疫分析、化學分析方法和生物傳感器等［13］。小白鼠生物法屬于最常用方法并且已成為諸多國家包括歐盟、日本等的官方檢測手段［14］。雖然此方法操作簡單，但需要殺害大量動物因而違反了動物保護原則［15］。在化學分析方法中，高效液相色譜法由于其能夠定性定量分析近年來受到關注，但此方法需要專業人員并且需要耗費大量昂貴試劑［16］。細胞檢查法通過檢查細胞形態和活性變化來檢查海洋水產品毒素，并且由于使用了哺乳動物細胞使得毒素評價更為直觀。但由于細胞檢查法屬于終點檢測因而無法監測整個過程［17］。免疫分析法通過抗原抗體反應雖然具有高特異性與靈敏度，但獲得其特殊的單克隆抗體是非常困難的并且實驗中很容易出現假陽性［18］。近十年來，生物傳感器法以其快速、簡單和高靈敏度等特點而備受矚目［19］。細胞傳感器利用活細胞作為敏感元件感應到細胞外微環境的波動，并能高效地評估藥物的性能［20-22］。細胞阻抗傳感器(ECIS)能夠通過細胞阻抗檢測細胞貼附，遷移和活性等細胞動態變化參數［23］。

本文基于細胞阻抗傳感器設計一種海洋水產品腹瀉性毒素檢測系統，具有新型的、高一致性、高通量等特點，用于海洋水產品毒性的快速檢測，是對水產品毒性快速檢測方法的補充和發展。本文將詳細介紹該系統的軟硬件設計，并且通過系統性能測試及毒素檢測實驗驗證系統的可行性。

1 系統設計

1.1 硬件設計

ECIS是一類電化學傳感器，通過在參考電極上施加一個微小激勵電場，從工作電極上檢測出電極/細胞/溶液體系的阻抗。當電極裸露在溶液中時，電極阻抗主要由周圍區域的離子環境決定，這一阻抗稱為基線阻抗。當細胞貼附到電極上后，引起區域離子環境和電極/溶液界面特性的改變，從而導致電極/細胞/溶液體系阻抗的變化。細胞分布密度、細胞與電極間距、細胞形態等都能引起這一阻抗發生變化。生物阻抗測量主要分為電壓激勵電流測量和電流激勵電壓測量兩種方式，本系統硬件設計采用其中的電壓激勵電流測量的方式進行細胞阻抗測量。

下位機工作流程如圖2所示，儀器在上電之后立即進行系統初始化，具體包括晶振、MCU外部控制端口、通道選通、程控放大器及串行總線模塊的初始化。進行初始化后，系統下位機通過串口接收上位機端發送的控制指令，并根據預先設定好的通訊協議判斷指令是否正確。如符合檢測指令，下位機將通過通道切換，循環檢測傳感器芯片培養板上的16個通道的阻抗值。一輪檢測結束后，下位機通過串口將數據傳遞給上位機系統進行后續處理，之后重新進入等待指令狀態。Win_QextSerialPort等進行進一步的封裝處理。通信協議類是對系統自定義協議的讀取、保存和解析。

圖1 腹瀉性毒素檢測系統

圖2 腹瀉性毒素檢測系統下位機工作流程圖

監測層負責控制下位機并接收下位機數據，之后傳遞給數據處理層進行數據處理。為了保證系統的穩定性，本系統采用主-從模式進行上下位機交互，即上位機處于主要控制地位而下位機應答上位機控制。監測層為控制上下位機交互的主要層次，控制下位機的運行模式。

數據處理層主要是對ECIS數據進行在線處理與保存。ECIS在線處理方法除了監測下位機的阻抗數據，還有根據阻抗數據進行在線細胞指數計算。在進行細胞阻抗測量時，常使用細胞指數來表征細胞狀態［25］，其中細胞指數與阻抗之間的關系如下

1.2 軟件設計

本系統上位機軟件使用Qt Creator進行開發，設計語言采用的是C++。Qt是一個跨平臺的C++圖形用戶界面應用程序框架，提供給應用程序開發者建立藝術級的圖形用戶界面所需的所有功能。Qt很容易擴展，并且允許真正地組件編程。Qt具有優良的跨平臺特性，屬于面向對象，并且具有豐富的API，支持2D/3D圖形渲染等特點。結合Qt的優良特性，本系統軟件為達到可移植性及易維護性等需求，采用了分層架構模式來設計。其主要原則為任一一層元素僅與同一層的其他元素或者下一層元素發生關系。

如圖3(A)所示，本系統軟件主要分為4個層次，通訊層，監測層，數據處理層和UI顯示層等。

通訊層封裝了軟件系統與系統下位機通訊所需要的協議類，包括串口操作類和通信協議類。通訊層主要完成的功能包括串口參數的設置、打開、關閉、寫入、讀取和串口的校驗。此層也是對Qt串口類包括其中，CIk(t)表示第K個通道的細胞在t時刻的細胞指數，Zk(t)表示第K通道在t時刻的阻抗值，Zk(0)表示第K通道檢測初始點的阻抗值，Zk該通道腔內阻抗值。為了能進一步觀測毒素溶度變化對細胞的影響，我們采用標準化細胞指數的概念［26］，歸一化細胞指數與細胞指數的關系如下

其中，NCIk(t)表示第K個通道的細胞在t時刻的歸一化細胞指數，CIk(t)表示第K個通道的細胞在t時刻的細胞指數，CIk(tn)表示第K個通道的細胞在歸一化點tn時刻的細胞指數。

UI顯示層為系統與用戶交互的界面，用戶通過對UI界面的操作來控制整個系統。圖3(B)為系統軟件的主界面，其中區域1為參數設定按鈕區域，區域2為程序流程控制按鈕區域，區域3為系統16通道實時顯示選擇區域，區域4為實時數據顯示區域。本軟件界面顯示最主要部分區域4采用QWT進行制作。QWT是一個基于Qt開發的開源項目，其目標是以基于2D方式的窗體部件來顯示數據并可生成各種統計圖。

圖3 腹瀉性毒素檢測系統軟件

2 實驗結果與討論

2.1 系統性能測試

系統性能測試實驗采用與ECIS細胞培養板對應的阻抗進行長時程檢測，16通道分為40 Ω、70 Ω、95 Ω和120 Ω等，每種阻值各4個通道進行65 h長時監測。系統長時監測系統性能結果如圖4所示，表1和表2分別為系統性能測試阻抗和換算CI值的統計結果。阻抗監測結果中變異系數均在0.054%之下，換算CI值波動均在0.01之內。

圖4 腹瀉性毒素檢測系統性能測試

表1 實測16通道40 Ω、70 Ω、95 Ω和120 Ω的系統性能測試阻抗結果

表2 實測16通道40 Ω、70 Ω、95 Ω和120 Ω的系統性能測試CI值結果

2.2 細胞培養

實驗所采用的小鼠神經母細胞瘤(Neuro-2a)細胞株由浙江大學動科院方維煥教師惠贈。Neuro-2a細胞培養于含10%胎牛血清、1%的谷氨酰胺、1%的非必需氨基酸、1%的丙酮酸鈉、100 μg/mL鏈霉素、100 u/mL青霉素的RPMI-1640培養基(Gibco. USA)中，于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養。待細胞長至對數期，用胰酶-EDTA消化液(含胰蛋白酶0.25%，EDTA0.02%)消化細胞，按照1X105細胞/孔的濃度將細胞接種到阻抗芯片上。

2.3 腹瀉性毒素檢測

待細胞在ECIS培養板上培養16 h后，系統開始監測各個通道阻抗變化。之后8 h，即細胞接種到阻抗芯片上24 h后，分別往實驗組加入25 μg/L、50 μg/L和100 μg/L的海洋水產品腹瀉性毒素OA標準液。系統毒素檢測試驗結果如圖5所示。

系統毒素檢測實驗CI指數歸一化統計結果如圖6所示，CI指數歸一化以監測的第4 h為歸一化點進行歸一化。加藥前8 h，隨著細胞在ECIS培養板上生長、分裂而數量增加，從而腔內阻抗增加，CI指數增大，此結果與圖結果一致。加藥后，由于實驗組中OA毒素作用，抑制細胞生長，并且濃度越大作用越強，與圖所示結果一致。與對照組相比，實驗組隨著毒素溶度增大，CI指數下降越快。當CI指數達到最大值后，由于腔內營養液消耗殆盡，從而導致細胞凋亡，腔內阻抗變小，最終表現出CI指數的下降。ECIS培養板上對照組與100 μg/L實驗組作用下細胞培養情況分別如圖7(A)和(B)所示。圖7(A)對照組細胞生長狀況良好，圖7(B)中細胞在毒素作用下密度稀疏。

圖5 腹瀉性毒素檢測系統毒素檢測實驗結果

圖6 腹瀉性毒素檢測系統毒素檢測實驗CI指數歸一化結果

圖7ECIS培養板Neuro-2a細胞培養情況

實驗中用濃度為25 μg/L、50 μg/L和100 μg/L的海洋水產品腹瀉性毒素OA標準液作用Neuro-2a細胞。從圖中看到，相對于不加毒素的空白對照組，其他各組的阻抗在開始的20 h后均呈現快速減小，而其中實驗組中最大濃度100 μg/L在10 h內就和對照組有明顯下降，之后趨于緩和; OA毒素濃度越高，阻抗下降越快，下降幅度也越大并呈現出梯度分布。實驗通過長時監測對照組與實驗組的CI值變化，從而檢測海洋水產品腹瀉性毒素，并且通過CI曲線變化來反映細胞對毒素的長時響應。

3 結論

介紹了一種基于細胞阻抗傳感器的腹瀉性毒素檢測系統，致力于建立基于細胞傳感器的快速分析系統平臺，用于海洋水產品毒性進行分析評價。本系統包括下位機硬件系統和上位機軟件系統，并且在對系統平臺的性能測試后，采用神經母細胞瘤細胞(Neuro-2a)結合系統平臺的ECIS細胞培養板，通過對腹瀉性貝毒(DSP)大田軟海綿酸(OA)進行毒性檢測，實現了系統平臺實時無損快速檢測毒素的功能。研究結果表明，基于細胞傳感器的海洋水產品腹瀉性毒性快速分析系統具備快速，長期，無損和高通量測量的特點，為腹瀉性毒素檢測提供了新的平臺。

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蘇凱麒(1990-)，男，浙江大學，碩士研究生，主要研究方向為細胞傳感器與海洋水產品毒素檢測，sukaiqi@zju. edu.cn;王平(1962-)，男，浙江大學，教授，博士生導師，主要研究方向為傳感器與檢測技術、生物芯片與生物電子學、人工嗅覺與人工味覺等，cnpwang@ zju.edu.cn。

基于細胞阻抗傳感器的腹瀉性毒素檢測系統設計與實現*

蘇凱麒，鄒玲，王琴，黎洪波，曹端喜，鄒瞿超，周潔，胡寧，王平*
(浙江大學生物傳感器國家專業實驗室，生物醫學工程教育部重點實驗室，生儀學院，杭州310027)

針對海洋水產品腹瀉性毒素檢測問題，設計了一種新型的基于細胞阻抗傳感器(ECIS)的毒素快速檢測分析系統。相對于傳統的毒素檢測方法，該系統具有操作簡便，高一致性和高通量等特點。介紹了系統的硬件設計和軟件設計，通過對系統整體性能測試以及使用神經母細胞瘤細胞(Neuro-2a)對腹瀉性貝毒(DSP)大田軟海綿酸(OA)進行毒性檢測實驗，用以驗證系統平臺的可行性。實驗結果表明，基于細胞傳感器的海洋水產品腹瀉性毒性檢測系統具備快速，長期，無損和高通量測量的特點，為腹瀉性毒素檢測提供了新的平臺。

ECIS傳感器;腹瀉性貝類毒素;大田軟海綿酸;毒素檢測系統

TP216

A

1004－1699(2014)03－0283－06

2013-12-18修改日期:2014-02-21

C:7230J

10.3969/j.issn.1004－1699.2014.03.001

項目來源:海洋公益項目(201305010)