TNNI3K基因表達(dá)與大鼠心肌肥厚形態(tài)學(xué)變化相關(guān)性研究

楊 冬，王 切，米立國*，張 玉(.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院急診科，河北 石家莊 05005；.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 石家莊05007；.河北省石家莊市第一醫(yī)院老年病二科，河北 石家莊 0500)

·論著·

TNNI3K基因表達(dá)與大鼠心肌肥厚形態(tài)學(xué)變化相關(guān)性研究

楊 冬1，王 切2，米立國2*，張 玉3
(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院急診科，河北 石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 石家莊050017；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院老年病二科，河北 石家莊 050011)

目的觀察心肌肥厚發(fā)生和發(fā)展過程中心臟結(jié)構(gòu)的變化，及其與TNNI3K表達(dá)的相關(guān)性。方法采用腹主動脈縮窄術(shù)制備壓力超負(fù)荷大鼠模型；通過HE染色、投射電鏡觀察心肌肥厚形態(tài)學(xué)變化；利用免疫組織化學(xué)染色法檢測模型中TNNI3K基因的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果各對照組心肌纖維排列整齊；2周模型組的心肌細(xì)胞彌漫性肥大，線粒體增多；4周模型組的心肌細(xì)胞更加肥大，心肌纖維走行紊亂，可見間質(zhì)纖維化；6周模型組的心肌細(xì)胞進(jìn)一步肥大，肌纖維斷裂，線粒體密集增多并可觀察到死亡細(xì)胞。TNNI3K mRNA和蛋白的相對表達(dá)量逐步增強(qiáng)。結(jié)論隨著超負(fù)荷心肌肥厚的發(fā)展，TNNI3表達(dá)逐漸增強(qiáng)，表明其參與了超負(fù)荷心肌肥厚的發(fā)生。

心肌病，肥厚性；基因表達(dá)；大鼠

心肌肥厚是心肌細(xì)胞對多種損害心臟泵功能的病理性刺激的一種代償反應(yīng)，以代償性增加心臟的泵血功能。在持續(xù)性刺激(力學(xué)信號、神經(jīng)激素信號和細(xì)胞因子信號等)作用下，心肌細(xì)胞肥大，引發(fā)心室重塑，最終致使心功能受損，以至于心力衰竭[1]。因此，抑制病理性心肌肥厚的進(jìn)展是控制心力衰竭發(fā)生的一條有效途徑。在心肌肥厚發(fā)生的分子機(jī)制中，首先即刻早期基因被激活，隨之胎兒型基因被重新激活,肌球蛋白和肌動蛋白的基因等表達(dá)增強(qiáng)[2-3]。人心肌特異表達(dá)心激酶(cTnI-interactingkinase，TNNI3K)是在心臟特異性表達(dá)的心激酶基因，其cDNA全長約3 420bp，編碼835個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量約為93 000[4]。分別以該基因的C末端和N末端序列為誘餌，經(jīng)醇母雙雜發(fā)現(xiàn)，心肌肌鈣蛋白I(cardiactroponinI，cTnI)和心肌肌動蛋白等一系列肌小節(jié)收縮調(diào)節(jié)蛋白基因?yàn)樵摶虻南嚓P(guān)分子。推測TNNI3K可能通過一條未知的信號傳導(dǎo)通路參與了對肌小節(jié)收縮蛋白的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控心肌收縮能力。現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：TNNI3K單克隆抗體(阜外心血管病醫(yī)院孟憲敏教授提供)；谷氨酰胺、丙酮酸鈉、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)購于上海今邁生物科技有限公司；SP檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；二抗試劑盒(SP工作液試劑盒)購自北京中山生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)試劑盒購于Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和取材：選用體質(zhì)量190～200g健康雄性SD大鼠，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為模型組和對照組，依據(jù)Anversa等[5]的方法實(shí)施腹主動脈縮窄術(shù)，制備動物模型，對照組只分離左腎動脈上方腹主動脈，并不結(jié)扎，其他步驟與模型組相同。術(shù)后2、4和6周時，每組各取8只，開胸取心。分離左心室，一部分放入液氮中用于總RNA的提取；一部分放入3%多聚甲醛和1%戊二醛混合固定液中固定，用于投射電鏡；另一部分放入4%多聚甲醛固定液內(nèi)固定，用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.3 組織切片HE染色和觀察：組織塊常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，切片厚度5μm，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌纖維形態(tài)變化，日本產(chǎn)Nikon光學(xué)顯微鏡下拍照。采用(Imageproplus6.0)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4 透射電鏡樣品制備并觀察心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化：常規(guī)固定、包埋，超薄切片(50nm)，載于200目銅網(wǎng)上；經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛電子染色，用Hitachi-7500型透射電鏡觀察、拍攝照片，加速電壓為80kV。

1.5 心肌組織TNNI3K免疫組織化學(xué)測定(SP法)：石蠟切片常規(guī)脫蠟及免疫組織化學(xué)染色。采用(Imageproplus6.0)圖像分析系統(tǒng)，將載玻片置于光學(xué)顯微鏡(×400)下，隨機(jī)挑選陽性細(xì)胞，更換視野，經(jīng)微機(jī)處理后得出各組平均光密度及標(biāo)準(zhǔn)差。光密度越大表示抗原含量越高。

1.6 用Trizol法提取總RNA：以GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-PCR。PCR引物(由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)GAPDH，上游，5′GCTGAGTATGTCGTGGAGT3′，下游，5′TCTTCTGAGTGGCAGTGAT3′；TNNI3K，上游，5′CATTGTGAAACTCCTGGTA3′，下游，5′AGGTGTTGGCTCGGTAT3′。取PCR產(chǎn)物各5μL進(jìn)行電泳、拍攝照片，經(jīng)成像分析系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的積分光密度值(integratedopticaldensity，IOD)，計(jì)算目的RNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 左心室壁的組織學(xué)變化：分別隨機(jī)選取結(jié)構(gòu)清晰、完整心肌細(xì)胞35個，取心肌細(xì)胞核40個，進(jìn)行對比觀察。對照組心肌纖維排列整齊，模型組較對照組細(xì)胞直徑及細(xì)胞核直徑明顯增大(P<0.01)；模型組各時點(diǎn)間細(xì)胞直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，細(xì)胞核直徑逐漸增大(P<0.05)；對照組各時點(diǎn)間細(xì)胞直徑及細(xì)胞核直徑比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，2。

2周模型組的心肌細(xì)胞彌漫性肥大，核深染。4周模型組的心肌細(xì)胞較2周更加肥大，心肌纖維走行紊亂，肌纖維間隙增寬，并可見間質(zhì)纖維化。6周模型組，心肌細(xì)胞進(jìn)一步肥大，肌纖維走行紊亂、斷裂，間質(zhì)纖維化嚴(yán)重(圖 1)。

GroupsDiameterofcardiacmyocytes2weeks4weeks6weeksFPControl9．71±1．049．61±0．719．89±0．721．0050．369Model15．35±0．9315．75±0．8015．86±1．142．6970．072 t23．91633．96026．195 P0．0000．0000．000

GroupsDiameterofcardiacmyocytesnucleus2weeks4weeks6weeksFPControl2．42±0．412．42±0．432．48±0．390．2850．752Model3．47±0．533．53±0．183．68±0．263．3180．039 t9．91015．05916．192 P0．0000．0000．000

圖1 6周模型組左心室心肌細(xì)胞(HE ×100)
Figure 1 HE staining for left ventricle of 6 weeks-model(HE ×100)

2.2 大鼠左心室壁的超微結(jié)構(gòu)變化：隨機(jī)挑選結(jié)構(gòu)清晰心肌細(xì)胞50個，進(jìn)行電鏡觀察，對照組各時點(diǎn)大鼠心肌原纖維排列整齊，明帶、暗帶、Z線及閏盤清晰，肌節(jié)長約1.63μm。線粒體分布在心肌原纖維之間，多為橢圓形，呈串珠狀排列，線粒體嵴清晰呈板層狀排列，較稀疏。腹主動脈縮窄術(shù)后2周時，心肌原纖維整齊，閏盤和肌節(jié)清晰，肌節(jié)增長；線粒體逐漸增多，并出現(xiàn)集結(jié)現(xiàn)象，集結(jié)處線粒體多呈圓形，線粒體嵴排列密集；間質(zhì)中微血管擴(kuò)張，2周細(xì)胞的胞核染色質(zhì)凝聚成塊狀，并邊聚化，提示早期凋亡。術(shù)后4周時，肌節(jié)長度與2周近似。但線粒體集結(jié)現(xiàn)象增強(qiáng)，集結(jié)處線粒體數(shù)量增多，排列密集，線粒體嵴的形狀和排列與2周組近似；細(xì)胞間質(zhì)中除可見微血管擴(kuò)張及早期凋亡的周細(xì)胞外，還可見晚期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核皺縮，其染色質(zhì)凝聚，邊聚化，出現(xiàn)凋亡小體。術(shù)后6周組時，肌節(jié)增長，線粒體集結(jié)處出現(xiàn)排列疏松區(qū)，線粒體嵴逐漸密集，線粒體嵴較其他組增厚。可以觀察到死亡的心肌細(xì)胞，其胞膜崩解，大部細(xì)胞器溶解，可見少量外形完整的圓形線粒體，細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)凝聚，并邊聚化。見表3，圖2。

GroupsLengthofmyocomma2weeks4weeks6weeksFPControl1．62±0．051．62±0．041．63±0．035．6430．213Model1．83±0．031．85±0．051．93±0．02316．0110．000 t7．3177．31718．299 P0．0000．0000．000

圖2 左心室超微結(jié)構(gòu)(電子顯微鏡 ×5 000)

A.2周對照組；B.2周模型組；C.4周模型組；D.6周模型組

Figure 2 The ultrastructure of left ventricle(電子顯微鏡 ×5 000)

A.Control of 2 weeks；B.Model of 2 weeks；C.Model of 4 weeks；D.Model of 6 weeks

2.3 TNNI3K mRNA表達(dá): 隨機(jī)挑選陽性細(xì)胞50個，腹主動脈縮窄術(shù)后2周時，TNNI3K mRNA和蛋白相對表達(dá)量略低于對照組，術(shù)后4、6周時，TNNI3K mRNA和蛋白的相對表達(dá)量高于對照組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組TNNI3KmRNA和蛋白相對表達(dá)隨時間延長為逐漸增加的趨勢(P<0.01)，對照組TNNI3KmRNA相對表達(dá)隨時間延長為逐漸增加的趨勢(P<0.01)，但TNNI3K蛋白相對表達(dá)隨時間延長為逐漸減少的趨勢(P<0.01)。見圖3～5,表4，5。

圖3 TNNI3K mRNA在室間隔的表達(dá)

M4W：4周模型組;C4W：4周對照組；M2W：2周模型組;C2W：2周對照組；M24H：24h模型組；C24H：24h對照組

Figure 3 The expression of TNNI3K mRNA in interventricular septum

C4W：Control of 4 weeks；M4W:Model of 4 weeks;C2W：Control of 2 weeks；M2W:Model of 2 weeks;C24H:Control of 24 hours;M24H:Model of 24hours

圖4 TNNI3K mRNA在室間隔的表達(dá)

M6W：6周模型組;C6W：6周對照組

Figure 4 The expression of TNNI3K mRNA in interventricular septum

M6W:Model of 6 weeks；C6W：Control of 6 weeks

圖5 左心室TNNI3K 表達(dá)(免疫組織化學(xué) ×200)

A.2周對照組；B.2周模型組；C.4周對照組；D.4周模型組； E.6周對照組；F.6周模型組

Figure 5 The expression of TNNI3K in the left ventricle detected by immunohistochemistry staining method

A.Control of 2 weeks;B.Model of 2 weeks;C.Control of 4 weeks;D.Model of 4 weeks;E.Control of 6 weeks;F.Model of 6 weeks

GroupsmRNAexpressionofTNNI3K2weeks4weeks6weeksFPControl0．43±0．060．42±0．040．59±0．06155．1140．000Model0．41±0．030．57±0．070．76±0．08377．4590．000 t2．10813．15612．021 P0．0370．0000．000

GroupsExpressionofTNNI3Kprotein2weeks4weeks6weeksFPControl0．16±0．020．15±0．020．15±0．015．5560．005Model0．15±0．010．17±0．020．20±0．02955．5560．000 t3．1625．00015．811 P0．0020．0000．000

3 討 論

心肌肥厚是由于心肌細(xì)胞受到不同的刺激因素(如機(jī)械牽拉、神經(jīng)內(nèi)分泌等)而導(dǎo)致的適應(yīng)性反應(yīng)，其產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，由超負(fù)荷的血流動力學(xué)變化而作用于心室壁，最后導(dǎo)致機(jī)械壓力的增加是引起心肌肥厚的最主要原因[6]。本研究利用腹主動脈縮窄術(shù)成功制備心臟肥厚模型，在腹主動脈狹窄后2～6周，心肌細(xì)胞的直徑、心肌細(xì)胞核的直徑及肌節(jié)長度均增加，線粒體集結(jié)增多，線粒體脊密集增厚，并且在中、晚期觀察到間質(zhì)纖維化和死亡細(xì)胞，死亡細(xì)胞的胞質(zhì)崩解，大部分細(xì)胞器溶解，并有少量圓形線粒體，細(xì)胞核皺縮染色質(zhì)凝聚、邊聚化。本研究結(jié)果顯示，模型組發(fā)生心肌肥厚，并且逐漸由代償性肥厚向失代償性肥厚進(jìn)展，模型組TNNI3K mRNA和蛋白相對表達(dá)均高于對照組，并表現(xiàn)為逐漸增加的趨勢。

TNNI3K是一種心肌特異表達(dá)蛋白，屬于MAPKKK家族[7]，它包含3個蛋白結(jié)構(gòu)域，其中C端1個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和1個酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，N端為7個錨蛋白重復(fù)(ankyrin repeat)結(jié)構(gòu)域。TNNI3K的結(jié)構(gòu)和基因序列與整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)相似。ILK參與信號分子從細(xì)胞膜到細(xì)胞內(nèi)的傳遞，并且在心臟生長、收縮和功能修復(fù)中起重要作用[8-9]。因?yàn)橄嗨菩蛄泻徒Y(jié)構(gòu)的基因具有相似的功能，所以推斷TNNI3K可促進(jìn)心臟生長和增強(qiáng)心肌收縮。另外，以C端序列構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒，進(jìn)行酵母雙雜交，表明TNNI3K與cTnI、心肌肌動蛋白等一系列肌小節(jié)收縮調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生相互作用[10]。新近的研究[11]證實(shí)，TNNI3K通過調(diào)節(jié)cTnI磷酸化促進(jìn)心臟重塑，TNNI3K基因表達(dá)導(dǎo)致心臟向心性肥大，在TNNI3K轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)鼠中，向心性肥大保持在12個月以上并且左心室功能仍然正常，表明TNNI3K的超表達(dá)在一定時期導(dǎo)致代償性心肌肥厚而不是失代償?shù)男募》屎瘛４送猓琓NNI3K基因在擴(kuò)張性心肌病患者的心臟組織中表達(dá)比正常人超出6倍[12]。在急性心肌梗死患者的血液中cTnI水平增加，TNNI3K可通過對cTnI的調(diào)節(jié)增加心肌收縮力，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用[13]。

綜上所述，TNNI3K可通過與肌小節(jié)內(nèi)的關(guān)鍵蛋白相互作用，促進(jìn)心臟生長，增加心肌收縮力，從而在一定程度上起到心臟保護(hù)作用。然而，TNNI3K表達(dá)水平的進(jìn)一步增加是否將會導(dǎo)致心肌失代償性肥厚？在心肌肥厚的進(jìn)展過程中，TNNI3K對cTnI的調(diào)節(jié)是否起到關(guān)鍵作用？TNNI3K又是通過何種途徑調(diào)節(jié)cTnI的？仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

[1] BALAKUMAR P,SINGH AP,SINGH M.Rodent models of heart failure[J].J Pharmacol Toxicol Methods，2007，56(1):1-10.

[2] USUI S,YEH I,TIAN B,et al.Global changes in gene expression during cardiac hypertrophy:a new direction of cardiac signaling research[J].J Mol Cell Cardiol,2006,41(2):219-222.

[3] VAN DEN BOSCH BJ,LINDSEY PJ,VAN DEN BURG CM,et al.Early and transient gene expression changes in pressure overload-induced cardiac hypertrophy in mice[J].Genomics,2006,88(4):480-488.

[4] CHANG TS,CHO CS,PARK S,et al.Peroxiredoxin Ⅲ,a mitochondrion-specific peroxidase,regulates apoptotic signaling by mitochondria[J].J Biol Chem,2004,279(40):41975-41984.

[5] ANVERSA P,HAGOPIAN M,LOMD AV.Quantitative radioautographic localization of protein synthesis in experimental cardial hypertrophy[J].Lab Invest,1973,29(3):282-292.

[6] BRANCACCIO M,HIRSCH E,NOTTE A,et al.Integrin signalling:the tug-of-war in hearthypertrophy[J].Cardiovasc Res,2006,70(3):422-433.

[7] MANNING G,WHYTE DB,MARTINEZ R,et al.The protein kinase complement of the human genome[J].Science,2002,298(5600):1912-1934.

[8] WANG L,WANG H,JUE Y,et al.Adenovirus-mediated overexpression of cardiac troponin I-interacting kinase promotes cardiomyocyte hypertrophy [J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2011,38(4):278-284.

[9] HANNIGAN GE,COLES JG,DEDHAR S.Integrin-linked kinase at the heart of cardiac contractility,repair,and disease[J].Circ Res,2007,100(10):1408-1414.

[10] LU H,FEDAK PW,DAI X,et al.Integrin-linked kinase expression is elevated in human cardiac hypertrophy and induces hypertrophy in transgenic mice[J].Circulation,2006,114(21):2271-2279.

[11] WANG X,WANG J,SU M,et al.TNNI3K,a cardiac-specific kinase,promotes physiological cardiac hypertrophy in transgenic mice[J].PLoS One,2013,8(3):e58570.

[12] COLAK D,KAYA N,AL-ZAHRANI J,et al.Left ventricular global transcriptional profiling in human end-stage dilated cardiomyopathy[J].Genomics,2009,94(1):20-31.

[13] LAI ZF,CHEN YZ,FENG LP,et al.Overexpression of TNNI3K,a cardiac-specific MAP kinase,promotes P19CL6-derived cardiac myogenesis and prevents myocardial infarction-induced injury[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008,295(2):H815.

(本文編輯：趙麗潔)

關(guān)于河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報變更投稿郵箱的說明

尊敬的作者：

本刊編輯部于2014年10月28日發(fā)現(xiàn)，其投稿郵箱hbydxb@126.com被盜，已不能使用。為了不影響廣大作者的投稿，本刊建立了新的投稿郵箱：hbydxb@sina.com。希望廣大作者相互轉(zhuǎn)告，繼續(xù)支持本刊的工作，謝謝！

《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》編輯部

CORRELATIONOFGENETNNI3KEXPRESSIONWITHMORPHOLOGICCHANGESOFCARDIACHYPERTROPHY

YANGDong1,WANGQie2,MILiguo2*，ZHANGYu3
(1.DepartmentofEmergency，theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050051，China;2.DepartmentofHumanAnatomy，theBasicMedicalCollegeofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China;3.TheSecondDepartmentofGeratology,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveTostudytherelationshipbetweencardiachypetrophyandgeneTNNI3Kexpressionbyobservingthemorphologicchangesduringthepressureoverloadhypetrophy.MethodsCardiachypertrophymodelsweremadethroughpartialligationofabdominalaorta.ThesectionsoftheventriclesampleswereusedforHEstainingorimmunohistochemicalstaining,thenobservedbylightmicroscope.Themixtureof3%paraformaldehydeand1%glutaraldehydewasusedinordertofixtheleftventriclesamplesfortransmissionelectronmicroscope.TherelativemRNAcontentofsamplesweremeasuredbyRT-PCRusingGAPDHasinnerstandard.ResultsThemyocardialcellsofcontrolgroupsarrangedtidilyandthenucleuswereclearunderthelightmicroscope.ThearrangementofthemyocardialcellsoftheMod4Wgroupbecametangly.Furthermore，thespaceamongthecellsbecamewider,andthefibrosiscouldbeobservedinextracellularmatrix.ThemyocardialhypotrophyoftheMod6WgroupwasmoreaggravatingthanthatoftheMod4Wgroup.Thefibrosiswashigh.Themitochondrialcristabecamethickerandconcentratedthanthatoftheothergroups.Thediedmyocardialcellcouldbeobserved.Alongwiththedevelopmentofthecardiachypetrophy,TNNI3Kgeneexpressiongraduallyincreased.ConclusionAlongwiththedevelopmentofthecardiachypetrophy,TNNI3Kexpressiongraduallyincreased.TheTNNI3Kinvolvedinthedevelopmentofcardiomyocyteshypertrophy.

cardiomyopathy,hypertrophic;geneexpression;rats

2014-03-20；

2014-07-10

楊冬(1981-)，男，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事急診科疾病診治研究。

R542.2

A

1007-3205(2014)11-1241-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.11.001

*通訊作者