FQ-PCR法痰結(jié)核桿菌DNA檢測及其臨床應(yīng)用

宋予娟

FQ-PCR法痰結(jié)核桿菌DNA檢測及其臨床應(yīng)用

宋予娟

目的 探討熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (FQ-PCR)法痰結(jié)核桿菌DNA檢測及其臨床應(yīng)用。方法 分別以FQ-PCR, 集菌培養(yǎng)和染色鏡檢檢測入選患者的痰標(biāo)本, 比較各方法在結(jié)核病診斷中的作用。結(jié)果 三種檢測方法的敏感性為71.8%, 39.0%, 26.5%, 顯示FQ-PCR法敏感度最高。結(jié)論FQ-PCR法具有簡便、快捷、敏感、特異性高的特點, 可以快速及時準(zhǔn)確的為臨床提供診斷依據(jù)。

痰;結(jié)核桿菌;熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病, 曾一度得到控制,但目前其仍是全球性的重大公共衛(wèi)生問題之一。結(jié)核分枝桿菌的實驗室檢測是結(jié)核病診斷和治療轉(zhuǎn)歸的重要依據(jù)。傳統(tǒng)結(jié)核桿菌檢測痰涂片抗酸染色鏡檢陽性率低, 集菌培養(yǎng)周期太長而熒光定量FQ-PCR是近年發(fā)展起來的一種重要的基因診斷技術(shù)［1］, 顯示出了其靈敏度高, 特異性強(qiáng), 快速簡便等特點, 得到了廣泛的應(yīng)用［2］。本研究采用Taqman熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測痰標(biāo)本結(jié)核桿菌DNA, 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年4月~2012年1月到本院診斷與治療患者的痰液標(biāo)本112份, 其中男74份, 女38份, 年齡17~65歲。病例入選根據(jù)臨床癥狀體征及胸部X線表現(xiàn)臨床診斷為結(jié)核病患者64例(肺結(jié)核組), 非結(jié)核病患者48例(非結(jié)核組)。

1. 2 痰標(biāo)本收集 使用帶蓋無菌樣本盒, 交由患者自行留取痰標(biāo)本。要求患者晨起后漱口, 深咳出1~2口痰入樣本盒,加蓋送檢。

1. 3 試劑和儀器 4%NaOH, FQ-PCR試劑盒由深圳凱杰生物工程有限公司提供, 儀器由上海宏石生產(chǎn)的熒光定量分析儀分析。

1. 4 抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法 操作參考《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程》［3］進(jìn)行。

1. 5 痰液DNA的提取 按試劑盒說明書取0.9 ml痰標(biāo)本加入2倍樣本體積40%NaOH液化后13000 r/min離心10 min去上清液向沉淀中加入1 ml滅菌水, 充分震蕩混勻, 13000 r/min離心10 min去上清液重復(fù)洗滌3次。沉淀中加入30 μl DNA提取液充分震蕩混勻100℃水域10 min待冷卻至室溫13000 r/min離心10 min去上清液備用。

1. 6 FQ-RCR法 按試劑操作說明書對上述DNA模版加入PCR反應(yīng)管, 按規(guī)定循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值(循環(huán)閾值)所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定出樣品的DNA拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

64例結(jié)核病例, 48例非結(jié)核病患者痰標(biāo)本染色鏡檢, 集菌培養(yǎng), FQ-PCR, 其陽性率分別為26.5%, 39.0%, 71.8%。而48例非結(jié)核組FQ-PCR檢測為0, 符合率100.0%。結(jié)果見表1。

表1 64例結(jié)核, 48例非結(jié)核病患者痰標(biāo)本染色鏡檢, 集菌培養(yǎng), FQ-PCR檢測結(jié)果(n, %)

3 討論

結(jié)核桿菌有人型、牛型、鳥型、鼠型和冷血動物型等,對人類主要是人型, 結(jié)核桿菌主要感染途徑為呼吸道, 也可以通過破損黏膜和消化道等多種途徑進(jìn)入人體, 侵犯各部位組織, 引起相應(yīng)的結(jié)核病, 以肺結(jié)核多見, 此結(jié)核為乙類傳染病, 危害大, 肺結(jié)核早診斷并進(jìn)行正規(guī)治療對預(yù)后治療有明顯的影響。病原學(xué)檢查確認(rèn)結(jié)核桿菌感染是肺結(jié)核診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

由此可見, 直接涂片法雖具有簡便、快捷、價廉等特點,但無法辨別出死菌和活菌且受實驗室條件、人員環(huán)境、技術(shù)水品的影響較大, 靈敏度低, 特異性差, 各種抗酸桿菌均可著色, 有些耐藥菌對抗酸染色不敏感, 難以查到出現(xiàn)假陽性結(jié)果。集菌培養(yǎng)法, 時間長且靈敏度低, 特異性差, 檢驗結(jié)果滯后［1］。而FQ-PCR法簡便快捷靈敏度高, 重復(fù)性好并且極大地縮短了檢測時間, 適合應(yīng)用于結(jié)核病的臨床快速診斷。FQ-PCR方法檢測的是病原體核酸, 不管結(jié)核桿菌是否為活的細(xì)菌, FQ-PCR均能檢出, 因此, 在經(jīng)抗生素治療1個療程后, 必須兩周后才能做FQ-PCR檢測, 以避免臨床假陽性。但目前試劑性能和結(jié)果檢測的方法各異, 在結(jié)核桿菌感染的診斷上, 抗酸染色和FQ-PCR同時陽性即可確診。如FQ-PCR陽性, 抗酸染色陰性, 應(yīng)重復(fù)檢測標(biāo)本, 直到FQPCR或抗酸染色陽性才可確診；如抗酸染色陽性, FQ-PCR法陰性, 應(yīng)重復(fù)檢測, 并排除非結(jié)核分歧桿菌感染的可能。并且FQ-PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌變化情況, 觀察抗結(jié)核藥物的治療進(jìn)展為臨床醫(yī)生及時掌握患者的病情和開展后續(xù)督導(dǎo)治療提供了動態(tài)數(shù)據(jù), 在實踐中起到了積極作用, 效果明顯, 有重要的臨床意義。

［1］ 鄔艷. 熒光定量PCR檢測痰結(jié)核桿菌特異性DNA序列及其臨床應(yīng)用. 中外醫(yī)學(xué)研究, 2012, 10(16):65-67.

［2］ 謝漢彬, 鄭崇輝, 黃國盛 . 實時熒光定量PCR法在檢測血漿結(jié)核桿菌DNA的應(yīng)用. 河北醫(yī)學(xué), 2012, 18(5):698-699.

［3］ 金建東. 熒光定量PCR檢測痰結(jié)核桿菌DNA及其臨床應(yīng)用.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2010, 31(22):3565.

Detection of sputum mycobacterium tuberculosis DNA by PCR method and its clinical application

SONG Yu-juan.
Department of Inspection, Henan Xinxiang City the First People’s Hospital, Xinxiang 453000, China

Objective To investigate the detection of sputum mycobacterium tuberculosis DNA by polymerase chain reaction (PCR) method and its clinical application. Methods Fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), culture and dyeing mirror inspection were applied to detect sputum specimens of chosen patients. The effects of the methods were compared in diagnosis of tuberculosis. Results The sensitivity of the three methods of detection were retrospectively 71.8%, 39%, and 26.5%, which showed that FQ-PCR had the highest sensitivity. Conclusion FQ-PCR method is simple, quick, and sensitive. It can quickly and timely provide clinical reference for diagnosis.

Sputum; Mycobacterium tuberculosis; Fluorescence quantitative polymerase chain reaction

2014-08-27］

453000 河南省新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院檢驗科