流式細胞術檢測風濕性心臟病合并心房顫動患者HCN2蛋白的表達

趙春鶴 周華富 張博 孫宇 劉文洲

流式細胞術檢測風濕性心臟病合并心房顫動患者HCN2蛋白的表達

趙春鶴 周華富 張博 孫宇 劉文洲

目的 對風濕性心臟病合并心房顫動患者右心耳組織超級化激活環核苷酸門控陽離子通道-2(HCN2)蛋白的表達進行分析和研究。方法 風濕性心臟病患者84例分為研究組(心房顫動)和對照組(竇性心律), 每組42例, 對兩組臨床資料進行回顧性分析。結果 研究組患者的左心房內徑(LAD)、右心房內徑(RAD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)明顯高于對照組, 右心室內徑(RVD)明顯小于對照組,兩組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；且研究組HCN2蛋白表達水平高于對照組。結論 風濕性心臟病合并心房顫動患者HCN2蛋白的表達與患者的心房顫動具有相關性。

心房顫動；右心耳組織超級化激活環核苷酸門控陽離子蛋白通道-2；表達

心房顫動(房顫)是最常見的持續性心律失常。隨著年齡增長房顫的發生率不斷增加, 75歲以上人群可達10%。房顫時心房激動的頻率達300~600次/min, 心跳頻率往往快而且不規則, 有時候可達100~160次/min, 不僅比正常人心跳快得多, 而且絕對不整齊, 心房失去有效的收縮功能［1］。房顫患病率的增長還與冠心病、高血壓病和心力衰竭等疾病的增長密切相關。本文主要就風濕性心臟病合并心房顫動患者HCN2蛋白的表達進行分析和研究, 以期能夠進一步提高患者的生命質量, 現作報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 隨機選取2013年2月~2014年2月本院收治的風濕性心臟病患者84例, 分為研究組(心房顫動)和對照組(竇性心律), 每組42例。對照組年齡16~76歲, 平均年齡(40±6.75)歲；研究組年齡18~78歲, 平均年齡(40±6.78)歲；兩組患者性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05), 具有可比性。

1. 2 方法

1. 2. 1 培養心房肌鑒定

1. 2. 1. 1 免疫熒光法 ①滴加0.01 mol/L, pH 7.4的PBS于待檢標本片上, 10 min后棄去, 使標本保持一定濕度。②滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液, 置于有蓋搪瓷盒內, 保溫30 min。③取出玻片, 置玻片架上, 先用0.01 mol/L, pH 7.4的PBS沖洗后, 再按順序過0.01 mol/L, pH 7.4的PBS三缸浸泡, 每缸3~5 min, 不時振蕩。④取出玻片, 用濾紙吸去多余水分。⑤立即用熒光顯微鏡觀察。即可判定為陽性。

1. 2. 1. 2 免疫組化 ①石蠟切片脫蠟至水。②3% 室溫孵育5~10 min。③蒸餾水沖洗, PBS浸泡5 min×2次。④5%~10%正常山羊血清封閉, 室溫孵育10 min, 傾去血清,勿洗。滴加一抗工作液, 37℃孵育1~2 h或4℃過夜。⑤PBS沖洗, 5 min×3次。⑥滴加適量生物素標記二抗工作液, 37℃ 孵育10~30 min。⑦PBS沖洗, 5 min×3次。⑧滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液, 37℃孵育10~30 min。⑨顯色劑顯色3~15 min。⑩自來水充分沖洗, 復染、脫水、透明、封片。

1. 2. 2 培養 取風濕性心臟病患者手術常規切除右心耳組織約300 mg, 10例無房顫史, 10例有房顫史, 10 min送至培養室, 在無菌操作臺下將右心耳組織剪碎約1.3 mm大小, 迅速將剪碎組織貼壁細胞培養瓶壁, 加入含10%的胎牛血清, 倒置約1 h后待組織貼壁緊密后翻轉培養瓶使組織碎塊浸沒在培養液中, 培養3~6 d可見組織塊周邊細胞生長, 10 d左右待細胞長滿瓶底約80%可傳代。取第三代傳代細胞, 做細胞爬片, 用人抗兔&-肌動蛋白抗體, 兔抗鼠fitc標記的二抗用免疫熒光法鑒定培養細胞為人心房肌細胞, 免疫組化法鑒定人心房肌細胞：人抗兔&-肌動蛋白抗體。流式細胞術檢測第三代細胞, 將貼壁細胞消化下來做流式樣品管, 檢測風濕性心臟病房顫史患者HCN2基因蛋白表達高于風濕性心臟病無房顫患者［2］。

1. 3 統計學方法 所有數據均采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差( x-±s)表示,采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 兩組臨床相關因素對照 研究組患者的左心房內徑(LAD)、右心房內徑(RAD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)明顯高于對照組, 右心室內徑(RVD)明顯小于對照組, 差異具有統計學意義(P＜0.05)。兩組患者的左心室射血分數(LVEF)差異無統計學意義(P>0.05), 左心房內徑與心房顫動的發生成正比, 左心室舒張末期內徑、左心室射血分數與心房顫動成負相關, 見表1。

2. 2 兩組患者臨床資料比較 兩組臨床資料比較差異具有統計學意義(P＜0.05), 研究組患者的HCN2蛋白表達明顯高于對照組, 見表2。

表1 兩組患者臨床相關因素對照( x-±s, mm)

表2 兩組患者臨床資料比較( x-±s)

3 討論

風濕性心臟病簡稱風心病, 是指由于風濕熱活動, 累及心臟瓣膜而造成的心臟瓣膜病變。表現為二尖瓣、三尖瓣、主動脈瓣中有一個或幾個瓣膜狹窄和(或)關閉不全。臨床上狹窄或關閉不全常同時存在, 但常以一種為主。患病初期常常無明顯癥狀, 后期則表現為心慌氣短、乏力、咳嗽、下肢水腫、咳粉紅色泡沫痰等心功能失代償的表現。本病多發于冬春季節, 寒冷、潮濕和擁擠環境下, 初發年齡多在5~15歲, 復發多在初發后3~5年內。由于心臟瓣膜的病變, 使得心臟在運送血液的過程中出現問題, 如瓣膜狹窄, 使得血流阻力加大, 為了射出足夠的血液, 心臟則更加費力地舒張和收縮, 這樣使心臟工作強度加大, 效率降低, 心臟易疲勞, 久而久之造成心臟肥大。如二尖瓣狹窄到一定程度時由于左心房壓力的增高, 導致肺靜脈和肺毛細血管壓力增高, 形成肺淤血, 肺淤血后容易引起以下癥狀：①呼吸困難；②咳嗽；③咳血, 有的還會出現聲音沙啞和吞咽困難, 嚴重的影響著人們的健康生活以及生活質量［3］。

流式細胞術是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段, 它可以高速分析上萬個細胞, 并能同時從一個細胞中測得多個參數, 與傳統的熒光鏡檢查相比, 具有速度快、精度高、準確性好等優點, 成為當代最先進的細胞定量分析技術。其在液流系統中, 快速測定單個細胞或細胞器的生物學性質, 并把特定的細胞或細胞器從群體中加以分類收集的技術。其特點是通過快速測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來定量測定細胞 DNA含量、細胞體積、蛋白質含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等許多重要參數。根據這些參數將不同性質的細胞分開, 以獲得供生物學和醫學研究用的純細胞群體, 目前最高分選速度已達到每秒鐘3萬個細胞［4-6］。

研究表明, 研究組患者的左房內徑、左室舒張末期內徑、右房內徑均明顯增大, 然而右室內徑減小, 左室射血分數降低；且研究組HCN2蛋白表達水平高于對照組, 兩組比較,差異具有統計學意義(P＜0.05)。

綜上所述, 風濕性心臟病合并心房顫動患者HCN2蛋白的表達與患者的心房顫動具有相關性。

［1］ 張復貴, 朱小琴, 李元紅, 等.風濕性心臟病患者發生心房顫動的臨床因素分析.中國心臟起搏與心電生理雜志, 2011, 25(6):520-521.

［2］ 任宇超, 張嵐, 劉靖童.風濕性心臟病患者發生心房顫動的臨床因素分析.當代醫學, 2013, 19(31):80-82.

［3］ 劉雄濤, 蘇菲菲, 尚福軍, 等.人類心房肌細胞的原代培養與鑒定.科學技術與工程, 2014, 14(2):6-7.

［4］ 劉慧, 于風旭, 毛亮.風濕性心臟病心房顫動患者 HCN2蛋白的表達.中國心臟起搏與心電生理雜志, 2013, 27(1):36-38.

［5］ 劉文洲, 孫宇王, 俊龍.二尖瓣狹窄合并心房顫動患者HCN2表達與測序.臨床心血管病雜志, 2014, 1(25):56-57.

［6］ 李勇, 馬瑞彥, 肖穎彬, 等. 風濕性二尖瓣病變并發心房顫動患者483例臨床分析. 第三軍醫大學學報, 2011, 33(10):1048-1051.

Flow cytometry in detection of HCN2 protein expression in patients with rheumatic heart disease complicated with auricular fibrillation

ZHAO Chun-he, ZHOU Hua-fu, ZHANG Bo, et al.
Department of Cardiothoracic Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

Objective To analyze and study the expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel-2 protein (HCN2 protein) in patients with rheumatic heart disease complicated with auricular fibrillation. Methods A total of 84 patients with rheumatic heart disease complicated with auricular fibrillation were randomly divided into research group (auricular fibrillation) and control group (sinus rhythm), and each group contained 42 cases. The clinical data of the two groups were retrospectively analyzed. Results The left atrial diameter (LAD), right atrial diameter (RAD), left ventricular end-diastolic dimension (LVEDD) were higher and right ventricular dimension (RVD) was lower in the research group than in the control group. The difference had statistical significance between the two groups (P<0.05). The research group had higher expression level of HCN2mRNA than the control group. Conclusion There is a correlation between the expression of HCN2mRNA and auricular fibrillation in patients with rheumatic heart disease complicated with auricular fibrillation.

Auricular fibrillation; Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel-2 protein; Expression

2014-09-03］

530021 廣西醫科大學第一附屬醫院心胸外科

周華富