改良愈瘍方對潰瘍性結腸炎模型小鼠腸道菌群的影響※

韓玉娜 朱葉珊 雷淼娜 張亞芳 聶欣寧

(河北省唐山市中醫醫院醫保科，河北 唐山 063000)

改良愈瘍方對潰瘍性結腸炎模型小鼠腸道菌群的影響※

韓玉娜 朱葉珊1雷淼娜1張亞芳1聶欣寧1

(河北省唐山市中醫醫院醫保科，河北 唐山 063000)

目的探討改良愈瘍方對右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的潰瘍性結腸炎(UC)模型小鼠腸道菌群的影響及治療作用。方法40只雄性C57BL/6小鼠按完全隨機法分為正常組、模型組、治療組、對照組各10只；正常組和模型組均用0.9%氯化鈉注射液灌腸，治療組給予改良愈瘍方灌腸，對照組給予柳氮磺胺吡啶灌腸，共治療14 d。觀察結腸長度和質量變化，以及對UC小鼠細菌移位的影響。結果治療組、對照組疾病活動指數(DAI)評分與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.01)；治療組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；治療組與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。飲用DSS后各組小鼠結腸長度均有不同程度縮短，治療組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，但與正常組相比較無統計學意義(P>0.05)，對照組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)；各組小鼠結腸質量比較，治療組與正常組、對照組、模型組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。結腸長度與質量之比比較，模型組明顯低于正常組(P<0.01)，治療組高于模型組和對照組(P<0.01，P<0.05)，正常組與治療組比較差異無統計學意義(P>0.05)。小鼠腸系膜淋巴結細菌移位率模型組明顯高于正常組、對照組(P<0.01)，治療組未發現細菌移位，與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論中藥灌腸有助于維持UC模型小鼠的腸道正常菌群，對實驗性模型小鼠結腸黏膜屏障具有保護作用。

復方;疾病模型，動物;結腸炎，潰瘍性；腸；灌腸；中藥療法

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)又稱非特異性潰瘍性結腸炎，是一種原因不明的炎癥性腸病。主要表現腹瀉、腹痛、黏液血便等，部分患者有發熱、體質量減輕、貧血等全身癥狀，少數患者有關節炎、脊柱炎、結節性紅斑等腸外表現。我們應用更接近人UC免疫學特點的右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的模型小鼠，通過改良愈瘍方灌腸治療，觀察其對腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只雄性C57BL/6小鼠(體質量18～22 g，7～12周)，購于北京維通利華有限公司[合格證號:SCXK(京)2011-0009]。DSS購于Sigma公司。

1.2 分組和模型[1]40只小鼠按隨機數隨機分入正常組、模型組和治療組和對照組，每組10只； DSS(分子量36 000～50 000)，10 g 溶于500 mL蒸餾水中，配成2%濃度，放入4 ℃冰箱保存。正常組小鼠自由飲用蒸餾水；其余3組自由飲用2%DSS 7 d。

1.3 藥物及給藥方法 改良愈瘍方(白頭翁15 g，穿山龍12 g，敗醬草12 g，徐長卿9 g，仙鶴草15 g，地榆15 g，檳榔9 g，薏苡仁15 g)，原液每mL含生藥3.0 g[相當于成人1.45 g/(kg·d)體質量]，由唐山市中醫醫院制劑室提供。4 ℃冰箱保存備用。1 mL/d灌腸。柳氮磺胺吡啶：上海三維制藥有限公司，規格：250 mg/片，國藥準字H31020450，批號：200609C15。將片劑用研缽研細，用100目篩篩過，用蒸餾水配成懸濁液，按0.30 g/kg體質量給藥，1 mL/d灌腸。模型組給予等容積0.9%氯化鈉注射液灌腸；治療組給予改良愈瘍方中藥灌腸；對照組給予柳氮磺胺吡啶懸濁液灌腸。均14 d為1個療程。

1.4 觀察指標

1.4.1 觀察造模期間動物的一般狀況、結腸長度及質量變化 第15 d，頸椎脫臼處死小鼠，游離結腸，取出整個結腸，用預冷無菌的0.9%氯化鈉注射液將結腸沖洗干凈，觀察并記錄各組小鼠結腸的大體改變、測量整個結腸長度。參照疾病活動指數(DAI)評分標準[2](見表1)每日觀察大鼠的體質量、糞便性狀和隱血(聯苯胺法測定)情況，并記錄評分。

表1 DAI評分標準

DAI=(體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數)/3

1.4.2 各組小鼠腸系膜淋巴結細菌移位率 剪取全部腸系膜淋巴結，稱質量后分別勻漿，將組織勻漿各0.1 mL在普通瓊脂培養基上(涂菌法)培養24 h后(37 ℃孵箱中)，根據菌落稀釋倍數計數菌落個數，換算成每g組織含菌量，用菌落形成單位(colony forming-unit，CFU)表示，每份標本均做雙份培養。結果計算細菌移位率(細菌培養陽性只數/培養總只數)。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般狀況 實驗期間，正常組小鼠反應靈活，毛色光潤，喜活動，主動覓食，大小便正常；模型組第2 d開始精神萎靡，懶于活動，被毛松散無澤，拱背，食量下降，拉稀便或黏液血便，形態消瘦，體質量下降，活動、進食減少。對照組、治療組治療前與模型組基本相同，治療后治療組的大便較成形、血便及體質量減輕較不明顯，一般狀況優于模型組及對照組。

2.2 各組DAI評分比較見表2。

組 別nDAI評分治療組101．23±0．15?△◇對照組101．16±0．29?模型組103．07±0．41正常組100．32±0．13

與模型組比較，*P<0.01；與對照組比較，△P<0.05；與正常組比較，◇P>0.05

由表2可見，治療組、對照組疾病活動指數(DAI)評分與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.01)；治療組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；治療組與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組小鼠結腸長度及質量變化比較 見表3。

表3 各組小鼠結腸長度及質量變化比較 ±s

與模型組比較，*P<0.01；與治療組比較，#P<0.01;與對照組比較，△P<0.05；與正常組比較，◇P>0.05，○P<0.01

由表3可見，飲用DSS后各組小鼠結腸長度均有不同程度縮短，治療組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，與正常組比較無統計學意義(P>0.05)，對照組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)；各組小鼠結腸質量比較，治療組與正常組、對照組、模型組差異均有統計學意義 (P<0.01)。結腸長度與質量之比比較，模型組明顯低于正常組(P<0.01)，治療組高于模型組和對照組(P<0.01，P<0.05)，正常組與治療組比較、對照組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 各組小鼠腸系膜淋巴結細菌移位率 見表4。

表4 各組小鼠腸系膜淋巴結細菌移位率比較

與治療組、對照組比較，*P<0.01；與對照組比較，△P<0.01；與正常組比較，◇P>0.05

由表4可見，腸系膜淋巴結細菌移位率模型組明顯高于正常組、對照組(P<0.01)，治療組未發現細菌移位，治療組與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

正常情況下，腸道上皮細胞和細胞之間的連接組成一道完整的黏膜屏障，阻止微生物及毒性大分子通過[3]。而腸黏膜屏障受損則可能是UC發病的始動因素。人體腸道處于復雜的帶菌環境，而易感個體腸黏膜屏障通透性顯著升高，使細菌通過腸黏膜屏障的機會增加，由此可見，及時清除黏附于腸壁表面和偶然突破腸黏膜屏障的致病菌是防止疾病發生和復發的關鍵。針對結腸黏膜屏障作用的治療，與中醫“未病先防，既病防變”的理論相切合。改良愈瘍方正是基于上述理論指導治療UC，從而為治療UC提供新的辦法，解除患者的病痛。方中白頭翁、敗醬草清熱解毒，消癰止痛，現代藥理研究表明，白頭翁、敗醬草可抗炎，促瘡面愈合[4]，同時敗醬草有利于提高血清超氧化物歧化酶 (SOD)及過氧化氫酶(CAT)的活性作用，有利于氧自由基的清除，減輕腸黏膜的損傷[5]。薏苡仁補脾除濕，同時也防止苦寒之品克伐脾胃，薏苡仁所含的薏苡仁油有鎮痛止血作用[6]。仙鶴草、地榆涼血止血。穿山龍、徐長卿祛風化濕，解痙止痛，藥理研究表明，二藥可抗炎、抗免疫，具有類激素作用[7-8]；此外，徐長卿能抑制胃腸蠕動，緩解平滑肌痙攣，其對金黃色葡萄球菌有中度敏感，對甲型鏈球菌、傷寒桿菌、大腸桿菌和福氏痢疾桿菌等多種細菌有抑制作用[9]。檳榔苦泄辛散，善行氣止痛、實腸止瀉，取“行氣則后重自除”之意。實驗中飲用DSS后各組小鼠結腸長度均有不同程度縮短，但治療后治療組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，但與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明改良愈瘍方可以阻止結腸的縮短，使結腸質量增加，這可能與改良愈瘍方減少腸道炎癥，促進潰瘍愈合，減少瘢痕形成有關。正常結腸能長期暴露于大量菌群之中而不出現結腸細菌移位，是因為結腸黏膜屏障作用強，正常的結腸黏膜上皮連接緊密，離子通透性較差，具有較好的表面細菌清除能力。實驗中，治療組沒有發現細菌移位，說明改良愈瘍方能加強結腸黏膜的屏障保護作用。通過動物模型實驗顯示，改良愈瘍方可有效改善癥狀，有效的控制細菌移位，其作用機制與保護結腸黏膜屏障有關，為臨床應用提供了理論依據。

[1] 李林，王竹立，柯劍婷，等.實驗性潰瘍性結腸炎動物模型選擇[J].世界華人消化志，2001，9(5):584-586.

[2] Cooper HS，Murthy SN，Shah RS，et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis[J].Lab Invest，1993，69(2):238-249.

[3] Sheikh SZ，Plevy SE.The role of the macrophage in sentinel responses in intestinal immunity[J].Curr Opin Gastroenterol，2010，26(6):578-582.

[4] 孔增科，李利軍，傅正良，等.敗醬草、北敗醬的鑒別與臨床合理應用[J].河北中醫，2009，31(2): 270-271，封3.

[5] 周金黃，王筠默.中藥藥理學[M].上海：上海科學技術出版社，1986:243-247.

[6] 陶小軍，雷雪霏，李云興，等.薏苡仁油的鎮痛止血作用[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16(17):161-163.

[7] 仇華泉，蘇酩，田景振.中藥穿山龍治療風濕病的研究進展[J].山東醫藥，2011，51(11):115-116.

[8] 趙麗萍.徐長卿研究進展[J].中國藥業，2011，20(2):79-80.

[9] 戎聚全，莫永安，張朝卿，等.民族藥徐長卿、半夏及紫蘇子的民族民間應用[J].黔南民族醫專學報，2003，16(2):63-64．

(本文編輯：李珊珊)

·信息·

廣東簡化單獨兩孩審批

5月6日，廣東省衛生計生委下發通知明確，今后該省單獨夫婦申請生育二孩，只需攜帶雙方身份證、戶口簿、結婚證、計劃生育服務證的原件和復印件，到規定的審批機構領取并填寫申請審批表，即可一站式辦理全部手續。

這意味著，申請單獨兩孩的夫婦既無需父母回戶籍地開具獨生子女證明，也無需再持《再生育申請表》回各自單位蓋章，申請流程大幅簡化。此前需要提供的頭胎子女出生證和獨生子女證，亦不再需要。

InvestigationofmodifiedYuyangprescriptiononintestinalflorainmicemodelwithulcerativecolitis

HANYuna*，ZHUYeshan，LEIMiaona，etal.

*HealthDepartment,TangshanHospitalofTraditionalChineseMedicineinHebeiProvince,HebeiTangshan063000

ObjectiveTo investigate the effect of modified Yuyang prescription on intestinal flora in mice model with ulcerative colitis induced by dextran sodium sulfate (DSS).Methods40 male C57BL / 6 mice were randomly divided into normal group，model group，treatment group and control group，10 mice in each group; normal group and model group were given 0.9% sodium chloride injection enema，enema of traditional Chinese medicine was used in treatment group，the control group was given sulfasalazine enema for 14d. The changes of colon length and quality and bacterial translocation in UC mice were observed.ResultsThere was significant difference between treatment group，control group and model group on the score of disease activity index (DAI) (P<0.01). There was significant difference between treatment group and control group on the score of DAI (P<0.05). There was no difference between treatment group and normal group on the score of DAI (P>0.05). The colon length in each group was shorten in differ degrees after the treatment of DSS. There was significant difference between treatment group and model group on the colon length (P<0.01). But there was no difference between treatment group and normal group on the colon length (P>0.05). There was significant difference between control group and model group on the colon length (P<0.01). There was significant difference between treatment group，normal group，control group and model group on the colon quality (P<0.01). The ratio of colon length and quality in model group was lower than that in normal group (P<0.01). The ratio of colon length and quality in treatment group was higher than that in model and normal group (P<0.01，P<0.05). There was no difference between treatment group and normal group on the ratio of colon length and quality (P>0.05). Mesenteric lymph node bacterial translocation rate in model group was higher than in normal group and control group (P<0.01). There was no bacterial translocation in treatment group and there was no difference between treatment group and normal group (P>0.05).ConclusionChinese medicine enema contributes to maintenance of the intestinal tract normal bacteria flora in mice model with ulcerative colitis，and has protection on colonic mucosal barrier of experimental model mice.

Ulcerative colitis; Chinese medicine enema; Mucosal barrier

※ 項目來源：2012年唐山市科學技術研究與發展指導計劃(編號：121302110b)

1 河北省唐山市中醫醫院脾胃病科，河北 唐山 063000

韓玉娜(1977—)，女，主治醫師，學士。從事內科臨床工作。

R-332;R282.710.7;R574.620.531

A

1002-2619(2014)05-0746-03

2014-01-15)