新型胰島素增敏劑的合成及其生物活性評(píng)價(jià)*

宋云龍，何新華，樊士勇，史衛(wèi)國(guó)，賈紅心，仲伯華

(1.中國(guó)人民解放軍 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 毒物藥物研究所，北京 100850;2.中國(guó)人民解放軍 第二炮兵總醫(yī)院 藥學(xué)部,北京 100088)

·研究論文·

新型胰島素增敏劑的合成及其生物活性評(píng)價(jià)*

宋云龍1,2，何新華1，樊士勇1，史衛(wèi)國(guó)1，賈紅心1，仲伯華1

(1.中國(guó)人民解放軍 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 毒物藥物研究所，北京 100850;2.中國(guó)人民解放軍 第二炮兵總醫(yī)院 藥學(xué)部,北京 100088)

以川芎嗪為結(jié)構(gòu)單元，與噻唑烷二酮類(lèi)降糖藥物的藥效團(tuán)組合，設(shè)計(jì)并合成了一個(gè)新的胰島素增敏劑——2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-N-[(3,5,6-三甲基-2-吡嗪基)-甲基]-苯甲酰胺(Ⅰ),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS表征。體外活性測(cè)試結(jié)果表明，Ⅰ在用藥量為1×10-5mol·L-1時(shí)對(duì)PPAR-γ的激動(dòng)活性與吡格列酮相當(dāng)；體內(nèi)生物活性測(cè)試結(jié)果表明，Ⅰ有抑制血糖升高的傾向,有一定的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。

噻唑烷二酮；胰島素增敏劑；激動(dòng)劑；合成；生物活性

以吡格列酮(Pioglitazone)、羅格列酮為代表的格列酮類(lèi)藥物是PPAR-γ特異性高親和力配體，通過(guò)提高骨骼肌和脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收和降低肝糖的輸出來(lái)提高細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，改善胰島素的抵抗?fàn)顟B(tài)，從而全面兼顧糖尿病高血糖、高胰島素血癥、胰島β細(xì)胞受損、胰島生理功能失活這4個(gè)病變環(huán)節(jié)，超越單一控制血糖的局限，全面控制糖尿病。但是,由于具有水腫、體重增加以及心血管方面的副作用[1-2]，羅格列酮已從歐盟市場(chǎng)撤出，吡格列酮的應(yīng)用也受到限制。

PPAP-α激動(dòng)劑可以促進(jìn)肝臟脂類(lèi)的氧化代謝，與PPAR-γ激動(dòng)劑有協(xié)同作用。因此，PPAR-α/γ雙重激動(dòng)劑能較好地解決PPAR-γ激動(dòng)劑帶來(lái)的病人體重增加等問(wèn)題，列扎類(lèi)化合物muraglitazar,Tsaglizazar及噻唑烷二酮類(lèi)化合物KRP-297就是這樣一類(lèi)藥物，它們可以改善肝脂代謝失調(diào)和提高對(duì)胰島素的敏感性，但是因?yàn)樵冖笃谠囼?yàn)階段中顯示具有心血管方面的副作用或者能夠誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)腫瘤的產(chǎn)生，該類(lèi)藥物均終止了研發(fā)。克服胰島素增敏劑類(lèi)藥物的副作用，是該類(lèi)藥物研發(fā)的瓶頸。

川芎嗪(四甲基吡嗪,1)對(duì)心血管系統(tǒng)有多方面的藥理作用,包括保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[3]、抗血小板聚集[4-5]、清除自由基[6-7]等。

通過(guò)對(duì)噻唑烷二酮類(lèi)化合物的逆合成分析，本文以1為結(jié)構(gòu)單元，與噻唑烷二酮類(lèi)降糖藥物的藥效團(tuán)組合，設(shè)計(jì)并合成了一個(gè)新的噻唑烷二酮類(lèi)化合物——2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-N-[(3,5,6-三甲基-2-吡嗪基)-甲基]-苯甲酰胺(Ⅰ,Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS表征。并對(duì)其生物活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

JNM-ECA-400400MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；API3000型電噴霧質(zhì)譜儀。

(Z)-2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-亞甲基]-苯甲酸甲酯(7)和2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-苯甲酸甲酯(8)按文獻(xiàn)[8]方法合成；硅膠GF254和柱層析硅膠(200目～300目，300目～400目)，青島海洋化工廠；其余所用試劑均為分析純，溶劑按常規(guī)方法經(jīng)干燥處理。

1．2 合成

(1)2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(2)的合成

在單口燒瓶中依次加入17.2g(53mmol)，N-溴代丁二酰亞胺(NBS)12.0g(53mmol)，四氯化碳120mL及催化量過(guò)氧化苯甲酰，攪拌下光照回流反應(yīng)12h。濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶3]純化得淡黃色液體24.0g，收率35%。

(2)N-[(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)-甲基]-鄰苯二甲酰亞胺(3)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入24.0g(18.7mmol)，DMF 50mL和鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽5.0g，攪拌下于90℃反應(yīng)5h。用水洗滌、無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑得34.8g，收率92.3%。

(3)2-氨基甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(4)的合成

在反應(yīng)瓶中加入34.8g和乙醇100mL,攪拌使其溶解；加入水合肼3mL，回流反應(yīng)至終點(diǎn)(隨反應(yīng)進(jìn)行有白色固體產(chǎn)生)。過(guò)濾除去不溶物，濾液濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=2∶1)純化得黃色油狀液體42.6g，收率61%。

(4)2-甲氧基-5-甲?；郊姿峒柞?6)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入2-羥基-5-甲?；郊姿?5)5.0g(30mmol)，三苯基磷15.6g(60mmol)，甲醇2.0g(62.5mmol)及THF 100mL,攪拌使其溶解；氮?dú)獗Ｗo(hù)，冰浴冷卻至0℃，緩慢滴加偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)9.2mL(60mmol)的THF(80mL)溶液(0.5h)，滴畢，于室溫反應(yīng)10h。濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=1∶1)純化得白色固體65.5g，收率94.8%。

(5)Ⅰ的合成

在反應(yīng)瓶中加入80.41g(1.5mmol)和DMF 30mL,攪拌使其溶解；依次加入三乙胺0.45g(4.5mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)0.57g(3mmol)，1-羥基苯并三唑(HOBt)0.20g(1.5mmol)，于室溫反應(yīng)10min。加入40.23g(1.5mmol)，于室溫反應(yīng)8h。減壓蒸除DMF，加50mL水，用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(DCM)∶V(MeOH)=10∶1]純化得白色固體0.33g，收率54%；1H NMRδ: 12.0(s,1H,CONHCO),9.290(t,J=4.4Hz,1H,CONH),7.161～7.838(m,3H,ArH),4.913(dd,J=4.8Hz,8.8Hz,1H,b-H),4.586(d,J=4.4Hz,2H,a-H),3.994(s,3H,OCH3),3.346(dd,J=8.4Hz,14.0Hz,1H,c-H),3.169(dd,J=8.4Hz,14.0Hz,1H,c-H),2.456～2.505(m,9H,ArCH3)；ESI-MSm/z: 415.5{[M+H]+}。

1．3 生物活性測(cè)試

(1)PPAR-γ的受體激動(dòng)活性

[9]方法進(jìn)行PPAR-γ的受體激動(dòng)活性測(cè)試。陽(yáng)性對(duì)照為吡格列酮，溶劑對(duì)照值為1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用相對(duì)激活倍數(shù)表示，值越大激活能力越高。

(2)葡糖糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)

受試動(dòng)物: 昆明種小白鼠18g～22g,雌雄各半,飼用商業(yè)飼料,任意飲水。在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3d后,取體表無(wú)損傷、一般情況好、反應(yīng)靈活的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。

受試藥物: 受試化合物均以生理鹽水及吐溫配成混懸液，給藥體積0.2mL/10g,給藥量10mg·kg-1,灌胃給藥,每天一次。

葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)方法[10]：取體健小鼠隨機(jī)分為以下各組(10只/組,雌雄各半),生理鹽水對(duì)照組,吡格列酮組和Ⅰ組,各組給藥劑量均為10mg·kg-1,連續(xù)給藥7d,至末次給藥后當(dāng)晚起,小鼠禁食約12h,次日分別在糖負(fù)荷前和糖負(fù)荷后1h和2h,經(jīng)小鼠尾靜脈取血,血糖儀測(cè)定糖負(fù)荷前后的血糖濃度。

(3)胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

按1.3(2)取小鼠分為3組(10只/組,雌雄各半),連續(xù)給藥14d。至末次給藥當(dāng)日晚至次晨空腹約12h,經(jīng)眼眶靜脈叢取血后,各組立即予以胰島素負(fù)荷0.2μ·kg-1皮下注射,注射1h和2h后,取血樣,按上述方法測(cè)定胰島素負(fù)荷前后小鼠血糖的變化。

(4)血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)

藥液配制：以DMSO為溶劑，配置c(Ⅰ)為100mmol·L-1;使用c(Ⅰ)：(0，0.1，1，10，100)×10-6mol·L-1，儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆?；過(guò)氧化氫的配制:先吸8.3μL 30%H2O2溶液加到1mL滅菌去離子水中，從中取10μL加入到2mL培養(yǎng)基中，配成4×10-4mol·L-1的濃度溶液。使用濃度2×10-4mol·L-1，作用4h。

細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)(CCK-8實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)方法:以3×103細(xì)胞/孔的起始濃度在96孔板中接種HUVEC細(xì)胞，每孔加入100μL RPMI 1640培養(yǎng)基。于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；每孔分別加入不同濃度[(0，0.1，1，10，100)×10-6mol·L-1]藥液，每個(gè)濃度做6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)不加藥液的對(duì)照孔。藥液處理12h后，加入2×10-4mol·L-1H2O2，作用4h 后，吸出培養(yǎng)基，并用新鮮的培養(yǎng)基洗2次；每孔加入100μL新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基(含1/10CCK8試劑)，于37℃孵育4h。用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照；在450nm測(cè)定吸光度(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率/%=(OD藥劑-OD空白對(duì)照)/(OD陰性對(duì)照-OD空白對(duì)照)×100%]。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ⅰ的生物活性

(1)PPAR-γ的受體激動(dòng)活性

PPAR-γ受體激動(dòng)活性初步評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，Ⅰ在用藥量為1.0×10-5mol·L-1時(shí)對(duì)PPAR-γ受體的激活作用與陽(yáng)性對(duì)照吡格列酮相當(dāng)。

Ⅰ 的耐糖和耐胰島素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表2和表3。由表2可見(jiàn)，Ⅰ對(duì)糖負(fù)荷的影響雖然與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異,但是其抑制血糖升高的傾向是顯而易見(jiàn)的。

由表3可見(jiàn)，在胰島素負(fù)荷的試驗(yàn)中,2h時(shí)對(duì)照組的血糖值已經(jīng)回升,而Ⅰ與Pioglitazone還有明顯降血糖的作用,說(shuō)明Ⅰ能明顯加強(qiáng)和延長(zhǎng)外源性胰島素的降血糖作用。因此可以初步肯定,Ⅰ具有一定的降血糖活性,且可能具有提高組織對(duì)胰島素敏感性的作用。

表1 PPAR-γ受體激動(dòng)活性Table1 In vitro PPAR-γ activities of PPAR-γ agonists

Ⅰ的細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn),Ⅰ在用藥量為(0.1～100)×10-6mol·L-1時(shí)未表現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒作用。

Ⅰ的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，Ⅰ在高濃度(1.0×10-4mol·L-1)對(duì)H2O2所致細(xì)胞毒性有一定的保護(hù)作用。

表2 Ⅰ的耐糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Oral glucose tolerance test in mice(x±SD,n=10)

表3 Ⅰ對(duì)小鼠胰島素負(fù)荷后血糖的影響(x±SD,n=10)Table3 Effect of Ⅰ on blood glucose under insulin load in mice(x±SD,n=10)

表4 Ⅰ的細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)Table4 Cell viability assay of Ⅰ

表5 Ⅰ的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)(x±SD,n=10)Table5 Protective effect of human umbilical vein endothelial cells of Ⅰ(x±SD,n=10)

3 結(jié)論

合成了一個(gè)新的噻唑烷二酮類(lèi)化合物——2-甲氧基-5-[(2,4-二氧代-5-噻唑烷基)-甲基]-N-[(3,5,6-三甲基-2-吡嗪基)-甲基]-苯甲酰胺(Ⅰ)。PPAR-γ的受體激動(dòng)活性初步評(píng)價(jià)結(jié)果表明，Ⅰ 在用藥量1.0×10-5mol·L-1時(shí)對(duì)PPAR-γ受體的激活作用與陽(yáng)性對(duì)照吡格列酮相當(dāng)。葡糖糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Ⅰ有明顯抑制血糖升高的傾向和能明顯加強(qiáng)和延長(zhǎng)外源性胰島素的降血糖作用。細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Ⅰ在(0.1～100)×10-6mol·L-1內(nèi)未表現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒作用；內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)表明：Ⅰ在高濃度(1.0×10-4mol·L-1)時(shí)對(duì)H2O2所致細(xì)胞毒性有一定保護(hù)作用。

Ⅰ兼有降血糖作用和內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，在一定程度上可以克服傳統(tǒng)PPAR-γ激動(dòng)劑在心血管方面的副作用，對(duì)于Ⅱ型糖尿病的治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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SynthesisandBiologicalEvaluationofaNovelInsulinSensitizerwithNaturalScaffolds

SONG Yun-long1,2, HE Xin-hua1, FAN Shi-yong1, SHI Wei-guo1, JIA Hong-xin1, ZHONG Bo-hua1

(1.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Science of PLA，Beijing 100850，China;2.Department of Pharmacy,the Second Artillery General Hospital of PLA,Beijing 100088,China)

A novel insulin sensitizer,5-[(2,4-dioxothiazolidin-5-yl)methyl]-2-methoxy-N-[(3,5,6-trimethyl-pyrazin-2-yl)methyl]benzamide(Ⅰ),was designed and synthesized by combining the fragment of tetramethylpyrazine with pharmacophore of TZDs.The structure was characterized by1H NMR and MS.Ⅰ showed approximately equal PPAR-γagonist activity to Pioglitazone at 1.0×10-5mol·L-1invitro.Ⅰ could protect the vascular endothelial cells and it can be expected that the cardiovascular side effects may be reduced.

TZDs;insulin sensitizer;agonists;synthesis；biological evaluation

2014-04-14

國(guó)家新藥創(chuàng)制重大專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2012ZX09301003-001-004)

宋云龍(1984-)，男，漢族，山東日照人，博士研究生，主管藥師，主要從事藥物合成的研究。Tel.010-66343013，E-mail: songyunlong12@163.com

仲伯華，研究員，Tel.010-66931693，E-mail: bohuazhong@yahoo.com

O626；O621.3

A

1005-1511(2014)05-0596-05