豬卵母細胞冷凍技術研究進展

吳佳寧

摘要：綜述了豬卵母細胞的冷凍保存方法和解凍方法，同時對影響冷凍的因素、保護劑的選擇等方面進行了探討并對豬卵母細胞冷凍技術進行了展望。

關鍵詞：卵母細胞；冷凍保存；豬

中圖分類號：S814.6文獻標識碼：B文章編號：1007-273X（2014）05-0071-02

近年來，隨著動物胚胎生物技術的迅速發展，對卵母細胞的需求日益增加，僅通過回收體內成熟卵母細胞已經無法滿足科研和生產的需要。而從屠宰場回收廢棄卵巢加以利用以獲取大量卵母細胞，可望成為一條有效的途徑。豬卵母細胞冷凍保存有助于優良地方豬種種質資源的保護，有助于資源共享與交換。動物卵母細胞是母系遺傳信息的載體，通過冷凍保存動物的卵母細胞，不但可以建立雌性動物的基因庫，還可充分利用卵母細胞資源，使體外受精、轉基因和核移植技術研究不受時間和地域的限制。另一方面，通過體外受精實現胚胎的體外生產，也可為胚胎生物技術提供豐富的材料來源；通過“試管動物”的生產，為克服珍稀瀕危動物的生殖疾病提供良好的解決方案。豬卵母細胞冷凍的研究還可為豐富低溫生物學的理論、方法和實踐提供重要的依據。

1豬卵母細胞的冷凍保存方法

1.1玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是把卵母細胞置于高濃度冷凍保護液中，經過短時間平衡（1～2 min） 或不平衡，直接投入液氮保存。它是超快速降低細胞溫度的一種冷凍模式，一般是將經過不同防凍劑濃度平衡的卵母細胞由0 ℃以上溫度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷凍多采用兩步法，即先用低濃度的冷凍保護劑預平衡3～5 min，再放入終濃度冷凍液，立即裝管，經液氮熏蒸1～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。該法的特點是細胞在室溫脫水后不需要降溫程序，簡便易行，該過程中水分在細胞內外都要結晶。

1.2程序化冷凍

卵母細胞用冷凍保護劑平衡處理后，以1 ℃/ min 速度降溫，在-5～-7 ℃誘發結晶，然后以0.3～0.8 ℃/ min的速度降溫至-30～-40 ℃，投入液氮中保存。該法是程序化冷凍的基礎程序。將GV期或MII期卵母細胞在TCM199中洗2～3次，轉移到冷凍保護劑中，進行逐步濃度梯度平衡。首先，將卵母細胞轉移到3%EG中平衡5 min，再轉移到6%EG中平衡5 min，最后轉移到9%EG中平衡5 min，并裝入0.25 mL的塑料麥管，每管含卵母細胞約15枚。

裝管順序和各部分的量分別為：冷凍液（4 cm）→空氣（0.5 cm）→含卵母細胞冷凍液（2 cm）→空氣

摘要：綜述了豬卵母細胞的冷凍保存方法和解凍方法，同時對影響冷凍的因素、保護劑的選擇等方面進行了探討并對豬卵母細胞冷凍技術進行了展望。

關鍵詞：卵母細胞；冷凍保存；豬

中圖分類號：S814.6文獻標識碼：B文章編號：1007-273X（2014）05-0071-02

近年來，隨著動物胚胎生物技術的迅速發展，對卵母細胞的需求日益增加，僅通過回收體內成熟卵母細胞已經無法滿足科研和生產的需要。而從屠宰場回收廢棄卵巢加以利用以獲取大量卵母細胞，可望成為一條有效的途徑。豬卵母細胞冷凍保存有助于優良地方豬種種質資源的保護，有助于資源共享與交換。動物卵母細胞是母系遺傳信息的載體，通過冷凍保存動物的卵母細胞，不但可以建立雌性動物的基因庫，還可充分利用卵母細胞資源，使體外受精、轉基因和核移植技術研究不受時間和地域的限制。另一方面，通過體外受精實現胚胎的體外生產，也可為胚胎生物技術提供豐富的材料來源；通過“試管動物”的生產，為克服珍稀瀕危動物的生殖疾病提供良好的解決方案。豬卵母細胞冷凍的研究還可為豐富低溫生物學的理論、方法和實踐提供重要的依據。

1豬卵母細胞的冷凍保存方法

1.1玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是把卵母細胞置于高濃度冷凍保護液中，經過短時間平衡（1～2 min） 或不平衡，直接投入液氮保存。它是超快速降低細胞溫度的一種冷凍模式，一般是將經過不同防凍劑濃度平衡的卵母細胞由0 ℃以上溫度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷凍多采用兩步法，即先用低濃度的冷凍保護劑預平衡3～5 min，再放入終濃度冷凍液，立即裝管，經液氮熏蒸1～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。該法的特點是細胞在室溫脫水后不需要降溫程序，簡便易行，該過程中水分在細胞內外都要結晶。

1.2程序化冷凍

卵母細胞用冷凍保護劑平衡處理后，以1 ℃/ min 速度降溫，在-5～-7 ℃誘發結晶，然后以0.3～0.8 ℃/ min的速度降溫至-30～-40 ℃，投入液氮中保存。該法是程序化冷凍的基礎程序。將GV期或MII期卵母細胞在TCM199中洗2～3次，轉移到冷凍保護劑中，進行逐步濃度梯度平衡。首先，將卵母細胞轉移到3%EG中平衡5 min，再轉移到6%EG中平衡5 min，最后轉移到9%EG中平衡5 min，并裝入0.25 mL的塑料麥管，每管含卵母細胞約15枚。

裝管順序和各部分的量分別為：冷凍液（4 cm）→空氣（0.5 cm）→含卵母細胞冷凍液（2 cm）→空氣

摘要：綜述了豬卵母細胞的冷凍保存方法和解凍方法，同時對影響冷凍的因素、保護劑的選擇等方面進行了探討并對豬卵母細胞冷凍技術進行了展望。

關鍵詞：卵母細胞；冷凍保存；豬

中圖分類號：S814.6文獻標識碼：B文章編號：1007-273X（2014）05-0071-02

近年來，隨著動物胚胎生物技術的迅速發展，對卵母細胞的需求日益增加，僅通過回收體內成熟卵母細胞已經無法滿足科研和生產的需要。而從屠宰場回收廢棄卵巢加以利用以獲取大量卵母細胞，可望成為一條有效的途徑。豬卵母細胞冷凍保存有助于優良地方豬種種質資源的保護，有助于資源共享與交換。動物卵母細胞是母系遺傳信息的載體，通過冷凍保存動物的卵母細胞，不但可以建立雌性動物的基因庫，還可充分利用卵母細胞資源，使體外受精、轉基因和核移植技術研究不受時間和地域的限制。另一方面，通過體外受精實現胚胎的體外生產，也可為胚胎生物技術提供豐富的材料來源；通過“試管動物”的生產，為克服珍稀瀕危動物的生殖疾病提供良好的解決方案。豬卵母細胞冷凍的研究還可為豐富低溫生物學的理論、方法和實踐提供重要的依據。

1豬卵母細胞的冷凍保存方法

1.1玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是把卵母細胞置于高濃度冷凍保護液中，經過短時間平衡（1～2 min） 或不平衡，直接投入液氮保存。它是超快速降低細胞溫度的一種冷凍模式，一般是將經過不同防凍劑濃度平衡的卵母細胞由0 ℃以上溫度直接浸入液氮中保存。目前，玻璃化冷凍多采用兩步法，即先用低濃度的冷凍保護劑預平衡3～5 min，再放入終濃度冷凍液，立即裝管，經液氮熏蒸1～2 min后或不熏蒸而直接投入液氮。該法的特點是細胞在室溫脫水后不需要降溫程序，簡便易行，該過程中水分在細胞內外都要結晶。

1.2程序化冷凍

卵母細胞用冷凍保護劑平衡處理后，以1 ℃/ min 速度降溫，在-5～-7 ℃誘發結晶，然后以0.3～0.8 ℃/ min的速度降溫至-30～-40 ℃，投入液氮中保存。該法是程序化冷凍的基礎程序。將GV期或MII期卵母細胞在TCM199中洗2～3次，轉移到冷凍保護劑中，進行逐步濃度梯度平衡。首先，將卵母細胞轉移到3%EG中平衡5 min，再轉移到6%EG中平衡5 min，最后轉移到9%EG中平衡5 min，并裝入0.25 mL的塑料麥管，每管含卵母細胞約15枚。

裝管順序和各部分的量分別為：冷凍液（4 cm）→空氣（0.5 cm）→含卵母細胞冷凍液（2 cm）→空氣