重慶地區非小細胞肺癌表皮生長因子受體突變檢測與臨床病理特征分析

王曉慧 陳 虹

肺癌已躍居我國城鄉惡性腫瘤病死率的首位。因為多數患者在初次診斷時已處于晚期，且晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)對放化療敏感性不高，故5年生存率低，預后差。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)及表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)如厄洛替尼、吉非替尼的研究的不斷深入和臨床使用，讓晚期NSCLC的治療見到了曙光。而EGFR基因突變的患者對EGFR-TKI更敏感[1-3]。因此，EGFR突變檢測成為肺癌靶向治療的預測手段[4-5]。研究表明，EGFR基因的突變種類及突變率具有地區和種族差異。中國NSCLC患者EGFR突變率大于美國NSCLC患者[6]。在中國各省市的NSCLC患者EGFR突變的具體表現也不完全一致，安徽省以外顯子19突變為主。臺灣地區則以外顯子21突變為主，而上海的資料顯示兩者之間無差異[7-9]。外顯子19、21的突變特征也存在矛盾。Li等[10]對中國大陸的NSCLC患者EGFR突變研究顯示，在女性、有淋巴結轉移或Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者以外顯子21突變為主，外顯子19突變更常見于Ⅰ和Ⅱ期。而李梅芳等[11]研究發現外顯子19、21突變與患者年齡、性別、腫瘤TNM分期、吸煙狀態、標本來源、組織學類型均無明顯相關性。為進一步探討EGFR基因突變的差異，本研究用擴增阻滯突變系統(amplification refractory mutation system,ARMS)檢測重慶地區EGFR突變。了解重慶地區NSCLC患者EGFR基因突變情況及其與臨床病理特征的關系。

材料與方法

一、 臨床資料

回顧性分析2011年9月至2013年1月經病理或細胞學檢查確診為NSCLC，并在重慶醫科大學分子檢測中心行EGFR基因突變檢測的病例55例。其中，男32例，女23例。大于60歲29例，小于等于60歲26例。吸煙27例，不吸煙28例。非鱗癌42例(腺癌40例，腺鱗癌2例)，鱗癌13例。甲醛固定石蠟標本40例，胸水標本15例。依據國際防癌聯盟2009版對所有NSCLC患者進行臨床分期。Ⅰ期6例，Ⅱ期5例，Ⅲ期16例，Ⅳ期28例。依據1997年WHO吸煙定義：一生中吸煙連續或累積吸煙6個月或以上者，反之為非吸煙者。

二、 DNA提取及檢測方法

1. 石蠟組織標本DNA提取：經病理確認為腫瘤組織的石蠟標本，脫蠟后利用凱杰公司QIAamp FFPE組織DNA提取試劑盒(Cat NO.56404)提取DNA。所有步驟按石蠟樣品DNA 提取試劑盒操作說明操作。所提DNA需用紫外分光光度計測定濃度，其OD260/OD280在1.8～2.0內。提取完的DNA立即進行EGFR檢測。

2. 胸水標本DNA提取: 收集經鏡下脫落細胞檢測確定含肺癌細胞的新鮮胸水標本。以離心半徑 8 cm，2000 r/min常溫下離心15 min，去上清液，收集沉淀物。采用凱杰公司QIAamp組織DNA提取試劑盒(Cat NO.69506)提取DNA，所有步驟按組織標本提取試劑盒操作說明進行。所提取的DNA需用紫外分光光度計測定濃度，其OD260/OD280在1.8～2.0內。提取完的DNA立即進行EGFR檢測。

3. ARMS法檢測EGFR：所有提取DNA均采用ADx-ARMS人類EGFR基因29種突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技有限公司)，檢測EGFR基因外顯子18、19、20、21共29種權威機構提供的已知常見突變。所有步驟及結果解讀均按ADx-ARMS 試劑盒操作說明書進行操作。

三、 統計學分析

采用SAS統計學分析軟件處理檢測數據，組間率的比較行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義；外顯子19、21突變特征分析采用Fisher精確檢驗法(總例數小于40)，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 EGFR突變位點分析

在55例NSCLC患者中，檢測出EGFR突變14例(25.45%)，其中外顯子19突變8例(57.14%，8/14)，外顯子21突變5例(35.71%，5/14)，外顯子18、20同時突變1例(7.15%，1/14)，見表1。

表1 14例NSCLC患者EGFR體細胞突變位點

二、EGFR突變與臨床特征的關系分析

非鱗癌(腺癌、腺鱗癌)EGFR突變率為33.33%(14/42)，13例鱗癌無突變(0/13)。女性NSCLC患者EGFR基因突變率顯著大于男性患者(P=0.009)。不吸煙NSCLC患者EGFR突變率大于吸煙患者(P=0.017)。非鱗癌(腺癌、腺鱗癌)突變大于鱗癌患者(P=0.041)，差異均有統計學意義。對于年齡、TNM分期、標本種類、病理類型分組EGFR基因突變率差異無統計學意義，見表2。

三、 EGFR基因外顯子19、21突變特征分析

外顯子19、21突變與年齡相關。60歲以下以外顯子19突變為主，60歲以上的則以外顯子21多見。外顯子19、21突變與性別、吸煙狀態、TNM分期、病理類型、標本種類無明顯相關，見表3。

討 論

EGFR基因突變的晚期NSCLC患者用EGFR-TKI比使用化療具有更長的無進展生存期[12]。Heon等[13]也研究證實，EGFR基因突變的晚期NSCLC患者，用易瑞沙治療組較化療組相比，具有更低的中樞神經系統轉移的風險。EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者使用EGFR-TKI比化療具有更好的臨床獲益。

表2 NSCLC患者EGFR基因突變與臨床病理特征的關系[n(%)]

EGFR基因突變具有種族及地區差異。Sekine等[14]研究發現，在亞洲NSCLC患者EGFR總的突變率為31%，遠高于歐美患者的7%。本研究中，NSCLC總的突變率25.45%，較亞洲多中心調查的平均突變率稍低，但仍較歐美國家突變率高。Xu等[15]針對中國大陸NSCLC患者的研究提示，總突變率30.2%，女性患者突變率30.2%。本研究中，女性患者EGFR基因突變率為43.48%，處于較高水平。

多項研究提示，NSCLC患者EGFR突變與臨床特征相關。臺灣地區大樣本、多中心研究提示女性、腺癌、非吸煙患者使用厄洛替尼治療，具有更長的無進展生存期[16]。Kim等[17]對202例肺癌患者研究發現，女性(52.1vs. 13.0%)、非吸煙(47.8vs. 15.8%)、腺癌(35.2vs. 5.2%)患者具有更高的EGFR突變率。這一結論也多次得到其它研究證實[1,18]。本研究亦同樣提示女性(43.48vs. 12.5%)、非吸煙(39.29vs. 11.11%)、非鱗癌(腺癌、腺鱗癌)(33.33vs. 0.00%)患者的EGFR突變率更高，與前面研究結果相一致。Shiozawa等[19]對67例腺鱗癌患者研究證實，腺鱗癌EGFR基因突變與腺癌具有相似的臨床病理特征，故推測腺鱗癌中EGFR突變來自腺癌成分可能性大。該實驗進一步說明EGFR基因突變與病理類型相關。也有研究提出不同觀點，Kim等[20]檢測57例晚期腺癌、鱗癌患者血清中EGFR基因突變，兩者突變差異無統計學意義。其發生機制及結果準確性需進一步大樣本研究證明。另外，本研究發現胸水標本與石蠟組織標本EGFR突變差異無統計學意義。魏冰等[21]采用直接測序法檢測109例合并胸腔積液的肺腺癌患者的胸腔積液和組織標本外顯子19、21突變，發現兩者突變率分別為56.88%、53.21%(P=0.35)，與本研究結果相符。何臣等[22]用同樣方法檢測30例NSCLC患者的惡性胸腔積液EGFR突變率為35%。這些研究均提示惡性胸腔積液中EGFR突變仍有較高的檢出率，對于難以獲取組織標本的晚期NSCLC患者可以通過惡性胸腔積液進行EGFR檢測，從而預測EGFR-TKI的療效。

研究表明，外顯子19、21的突變也具有一定的臨床病理特征。目前發現EGFR突變位以外顯子19、21突變為主，與本研究結果相符[23]。Li等[10]對中國大陸的NSCLC患者EGFR突變研究顯示，在女性、有淋巴結轉移或Ⅲ-Ⅳ期患者以外顯子21突變為主，而外顯子19突變更常見于I和II期NSCLC患者，提示外顯子19突變比外顯子21突變具有較低的惡性傾向。另外，外顯子19突變更常見于左肺肺癌，外顯子21突變更常見于右肺肺癌。也有研究呈現相反的觀點，李梅芳等[11]研究發現外顯子19、21突變與患者年齡、性別、肺癌TNM分期、吸煙狀態、標本來源、組織學類型均無明顯相關性。本研究首次發現60歲以下以外顯子19突變為主，60歲以上以外顯子21突變為主。考慮這些差異與病例遺傳背景、檢測方法、樣本量、EGFR突變機制等多因素相關，仍需進一步大樣本研究探索EGFR外顯子19、21突變與年齡相關的機制及臨床意義。研究發現，不同的外顯子突變具有不同的臨床意義。Fukuoka等[24]研究發現，外顯子19、21突變對化療的有效率為43.2%、53.2%，對易瑞沙治療的有效率為84.8%、60.9%。Jackman等[25]也研究證實，外顯子19突變比外顯子21突變的患者用厄洛替尼或吉非替尼治療具有更好的無進展生存期和總生存期獲益。故外顯子19比外顯子21在療效上更具優勢。多項研究表明，外顯子20的T790M突變與EGFR-TKI的獲得性耐藥有關[26-27]。本研究發現外顯子18、20同時突變1例，其突變的臨床意義仍需要進一步研究。

EGFR-TKI已成為晚期NSCLC的主要治療方式。目前關于EGFR基因突變的狀態、與臨床病理特征的關系及其臨床意義的報道結果存在相互矛盾的地方，這可能與各地患者的遺傳背景、生活環境及肺癌的EGFR突變的發生機制相關。為進一步優化EGFR-TKI治療方案，延長NSCLC 患者的PFS 和OS，改善生活質量，獲得更高的社會經濟學價值，仍需進一步深入研究EGFR基因的突變。

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