四乙酰化龍膽苦苷理化性質(zhì)研究*

★ 曾文雪 宋曉玲 江澤慧 熊耀坤 王躍生

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330006；2. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江西 南昌 330006；3. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥所 北京 100700)

藥物的理化性質(zhì)是藥物分子結(jié)構(gòu)的綜合體現(xiàn)，它不僅是藥物呈現(xiàn)生物活性的一個(gè)重要因素，而且它密切關(guān)系著藥物的穩(wěn)定性、毒副作用、劑型及臨床使用等[1]。四乙酰化龍膽苦苷為龍膽苦苷四乙酰化產(chǎn)物，與龍膽苦苷具有相似的藥理活性，可發(fā)揮保肝利膽的作用。故本文通過(guò)前期研究制備的四乙酰化龍膽苦苷，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究，包括熔點(diǎn)、表觀溶解度、表觀油水分配系數(shù)、穩(wěn)定性等，為后續(xù)的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

SCL-10AVP shimadzu高效液相色譜儀(SPD-M10AVP 紫外檢測(cè)器、SIL-10ADVP自動(dòng)進(jìn)樣器)；齊勒管熔點(diǎn)測(cè)定儀；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)； LS-2000A低溫恒溫光照儀(上海黃海藥檢所)；LRH-250-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠)；101-3-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；AR-5120電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；四乙酰化龍膽苦苷(自制，純度大于98%)；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 熔點(diǎn)測(cè)定 取干燥至恒重的四乙酰化龍膽苦苷，用熔點(diǎn)毛細(xì)管制樣，于熔點(diǎn)儀上檢測(cè)，平行3份，以平均值作為檢測(cè)值，結(jié)果為137.9℃。龍膽苦苷的熔點(diǎn)為191℃，說(shuō)明龍膽苦苷結(jié)構(gòu)中引入乙酰基后，熔點(diǎn)降低。

2.2 表觀溶解度測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 色譜條件：以Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為固定相；以乙腈-水(55∶45)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；流速為1.0 mL/min。

對(duì)照品溶液的配制：取四乙酰化龍膽苦苷(純度>98%)適量，精密稱定，加乙腈溶解，配成濃度為0.531 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，用乙腈稀釋至10 mL，得龍膽苦苷乙酰化產(chǎn)物的濃度為0.0531 mg/mL。

線性考察：自動(dòng)進(jìn)樣器吸取2，5，8，10，15，20，30 μL對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量(Y)和峰面積(X)做線性回歸，得到回歸方程為Y=1×10-6X-0.0143 (r=0.9999)，結(jié)果表明，四乙酰化龍膽苦苷質(zhì)量在0.1062×10-3～1.593×10-3mg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.2 不同溶劑中的表觀溶解度測(cè)定 在10 mL具塞磨口試管中，分別加入4 mL以下溶劑：甲醇、乙醇、乙腈、水。取四乙酰化龍膽苦苷加入以上溶劑中，直至管壁掛有不溶解物為止。將所有試管蓋上塞子密閉，置于振蕩器中振蕩，溫度(25±1)℃，于24，48，72 h取樣，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，液相檢測(cè)，計(jì)算四乙酰化龍膽苦苷在不同溶劑中的溶解度。結(jié)果見表1。四乙酰化龍膽苦苷在水中的表觀溶解度為0.11mg/mL，說(shuō)明四乙酰化龍膽苦苷極微溶于水，且在溶解較慢。在有機(jī)溶劑中四乙酰化龍膽苦苷的表觀溶解度隨著溶劑非極性的增加顯著增加，在氯仿中的表觀溶解度比在水中大了10 000多倍。

表1 四乙酰化龍膽苦苷在不同溶劑中的表觀溶解度(mg/mL，±s，n=3)

2.3 表觀油/水分配系數(shù)測(cè)定 準(zhǔn)確量取70 mL水飽和的正辛醇，加入一定量的四乙酰化龍膽苦苷，超聲溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)HPLC檢測(cè)，測(cè)得濃度作為總濃度(C總)。精密吸取5 mL經(jīng)過(guò)濾的水飽和正辛醇含藥溶液至3個(gè)玻璃管中，都加入正辛醇飽和的水溶液5 mL。置于振蕩器中振蕩，溫度(37±1)℃，72 h后，分別吸取醇層及水層，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣檢測(cè)。正辛醇層、水層中含量分別為1.95±0.04，0.078±0.003mg/mL，lgP為1.40。

2.4 穩(wěn)定性考察

2.4.1 高溫試驗(yàn) 將一定量白色粉末狀供試品置于培養(yǎng)皿中，攤成≤5mm厚的薄層，60℃溫度下放置10天，于第5天和第10天取樣，觀察外觀，檢測(cè)含量[2]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四乙酰化龍膽苦苷在高溫條件下放置10天，外觀由白色粉末變成淡黃色團(tuán)狀，含量具有顯著變化，結(jié)果表明四乙酰化龍膽苦苷對(duì)溫度敏感。結(jié)果見表2。

表2 高溫試驗(yàn)結(jié)果±s，n=3)

2.4.2 高濕度試驗(yàn) 將一定量白色粉末狀供試品置于培養(yǎng)皿中，攤成≤5mm厚的薄層，置于恒濕干燥器中，干燥器下部放置KNO3飽和溶液形成相對(duì)濕度92.5%的恒濕條件。供試品在高濕度條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，觀察外觀，稱量吸濕增重及檢測(cè)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四乙酰化龍膽苦苷在高濕條件下放置10天，外觀未見明顯改變，含量無(wú)顯著變化，且第5天、第10天吸濕率均小于0.1%，結(jié)果表明四乙酰化龍膽苦苷對(duì)濕度不敏感。結(jié)果見表3。

表3 高濕度試驗(yàn)結(jié)果±s，n=3)

2.4.3 強(qiáng)光照射試驗(yàn) 將一定量供試品置于培養(yǎng)皿中，攤成≤5mm厚的薄層，置于裝有日光燈的光照箱內(nèi)，于照度為4500±500lx的條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，觀察外觀，檢測(cè)含量。結(jié)果見表4。結(jié)果表明，四乙酰化龍膽苦苷在高溫條件下放置10天，外觀未見明顯改變，含量有一定下降，表明四乙酰化龍膽苦苷對(duì)強(qiáng)光敏感。

表4 強(qiáng)光照射試驗(yàn)結(jié)果±s，n=3)

2.4.4 不同pH條件下的穩(wěn)定性 精密稱取5 mg四乙酰龍膽苦苷于10 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得四乙酰龍膽苦苷儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液1 mL于10 mL容量瓶中，加入37℃恒溫水浴中預(yù)熱的pH 2.0、5.0、6.8、7.8～8.0磷酸鹽緩沖液及pH 1.2鹽酸溶液至刻度，搖勻，至37℃恒溫水浴，于0,1,2,4,6,8,12,24 h取樣0.5 mL，冰浴終止反應(yīng)，放至室溫后，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果表明，四乙酰化龍膽苦苷在酸性條件下易降解，在pH1.2和pH2.0磷酸鹽緩沖液中12 h內(nèi)降解均大于50%，隨著pH值增加，四乙酰化龍膽苦苷降解減少。結(jié)果見圖1。

圖1 在不同pH溶劑中的含量變化

3 討論

3.1 四乙酰化龍膽苦苷在水中的表觀溶解度僅為0.11mg/mL，說(shuō)明四乙酰化龍膽苦苷微溶于水，而且在水中溶解較慢，48h達(dá)到溶解平衡。龍膽苦苷在水中的表觀溶解度為76.5mg/mL[3]，龍膽苦苷結(jié)構(gòu)中引入四個(gè)乙酰基后，水溶性大大降低。四乙酰化龍膽苦苷在乙醇中溶解較慢，達(dá)到平衡溶解時(shí)間較長(zhǎng)，在甲醇中溶解較快，但溶解度比乙醇中小。易溶于乙腈和氯仿中。

3.2 本文采用操作簡(jiǎn)單的搖瓶法測(cè)定四乙酰化龍膽苦苷的油/水分配系數(shù)，試驗(yàn)選用正辛醇為模擬生物膜相的有機(jī)溶劑，主要是因?yàn)檎链紭O性與多數(shù)有機(jī)體液的極性相差不大，其溶解度參數(shù)與生物膜的溶解度參數(shù) 21.07 MPa1/2一致[4]。過(guò)低的P值(logP<-2)，化合物不能穿過(guò)脂質(zhì)膜；相反，過(guò)高的P值(logP>3，化合物因?yàn)橹苄詮?qiáng)很難從細(xì)胞另一側(cè)的膜釋放出來(lái)，故藥物的最佳P值在-1

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