Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化金銀花中綠原酸提取工藝

★ 譚梅英 詹利之

(1.廣東省第二中醫(yī)院藥學(xué)部 廣東 廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心 廣東 廣州 510095)

金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花。夏初花開放前采收，干燥。具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效。用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫病發(fā)熱等癥[1]。金銀花具有廣譜的抑菌活性，并且對(duì)消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)均有一定的藥理作用。綠原酸為金銀花抗菌作用的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用[2-8]。

本文采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化金銀花中綠原酸的提取工藝[6-8]，將多個(gè)因素與指標(biāo)的交互關(guān)系以二次多項(xiàng)式擬合，并對(duì)等高線進(jìn)行分析，研究各個(gè)自變量之間以及與因變量之間的函數(shù)關(guān)系，得到擬合度優(yōu)良的回歸方程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)金銀花提取工藝的優(yōu)化。

1 儀器與試藥

安捷倫1100型高效液相色譜儀(美國(guó))，四元梯度泵，配有DAD檢測(cè)器；雙杰JJ-BC系列電子分析天平(美國(guó))。

金銀花(購(gòu)于廣州致信藥業(yè)有限公司，批號(hào)130112)，經(jīng)鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花；綠原酸對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110753-201314)；高效液相色譜用乙腈為色譜純，高效液相色譜用水為雙蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 金銀花中綠原酸的含量測(cè)定

2.1.1 綠原酸含量測(cè)定色譜條件 所使用的色譜柱為安捷倫公司出品的Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)柱；實(shí)驗(yàn)所采用的流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87)(V/V)；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積：10μL；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm。

2.1.2 綠原酸對(duì)照品溶液的制備 取于中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買的綠原酸對(duì)照品(批號(hào)110753-201314)適量，精密稱定，置于棕色容量瓶中，加入50%甲醇制成每1mL含60.12μg的綠原酸對(duì)照品溶液，在10℃以下保存，備用。

2.1.3 金銀花供試品溶液的制備 精密吸取金銀花提取液(表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得)1.0mL，置50mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性范圍的考察 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下配制好的對(duì)照品溶液1，2，4，6，8，10mL，分別置10mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，制得綠原酸濃度為6.012，12.024，24.048，36.072，48.096，60.120μg/mL的溶液。精密吸取上述一系列綠原酸對(duì)照品溶液各10μL，注入安捷倫高效液相液相色譜儀中，依法測(cè)定。得到線性回歸方程Y=2638.6418X+3.6268，r=0.99993，其中自變量(X)為進(jìn)樣量(μg)，因變量(Y)為峰面積。結(jié)果表明，綠原酸在0.06012～0.60120μg范圍內(nèi)，其進(jìn)樣量(μg)與峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.1.5 綠原酸含量測(cè)定精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液(24.048μg/mL)10μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。計(jì)算綠原酸峰面積值RSD=0.32%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 綠原酸含量測(cè)定穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(6號(hào))10μL，分別于0，1，2，4，8，12h進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算綠原酸峰面積值RSD=0.73%。表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 綠原酸含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一提取液樣品(6號(hào))6份，按上述的方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算供試品中綠原酸的含量。結(jié)果綠原酸的平均含量為1.56%，RSD=1.19%。結(jié)果表明，此方法的重現(xiàn)性良好。

2.1.8 綠原酸含量測(cè)定加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的提取液樣品(6號(hào)，綠原酸1.56%)6份，每份0.5mL，分別精密加入綠原酸對(duì)照品溶液(21.120μg/mL)0.5mL，按上述的方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果綠原酸平均回收率為98.13%，RSD為1.91%(n=6)。表明所建立的綠原酸含量測(cè)定方法具有良好的回收率。

2.2 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化金銀花中綠原酸的提取工藝

2.2.1 綠原酸提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 本實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert7.0.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，綜合單因素考察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取溫度固定為100℃，提取次數(shù)固定為2次。選擇乙醇濃度、溶劑體積和提取時(shí)間3個(gè)考察因素，進(jìn)行編碼，以綠原酸的提取率為因變量(Y)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1。

表1 綠原酸提取工藝Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 采用方差分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)。由表2可知，乙醇濃度一次項(xiàng)、溶劑體積二次項(xiàng)與提取時(shí)間二次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，乙醇濃度二次項(xiàng)、溶劑體積一次項(xiàng)與提取時(shí)間一次項(xiàng)達(dá)到顯著水平(P<0.05)。經(jīng)過(guò)多元回歸擬合，得到綠原酸提取率對(duì)乙醇濃度(A)、溶劑體積(B)和提取時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y=0.025417+0.014937A+0.070500B+0.014764C+1.50000×104AB-4.16667×106AC-3.33333×105BC-1.13542×104A2-2.31667×103B2-8.37963×105C2

式中，Y-綠原酸提取率(%)；A、B、C-分別代表乙醇濃度(X1、X2、X3)、溶劑體積(X1、X2、X3)、提取時(shí)間(X1、X2、X3)。結(jié)果表明，所建立的回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好。

表2 二次回歸方程方差分析

2.2.3 綠原酸提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 采用軟件，作出相應(yīng)的曲面圖和等高線圖，如圖1～6所示。結(jié)果表明，綠原酸的提取率隨著乙醇濃度和提取時(shí)間的增加呈線性增加；溶劑體積對(duì)綠原酸提取率的影響近似呈二次關(guān)系，當(dāng)乙醇濃度在75%左右，溶劑體積在17倍左右，提取時(shí)間在82min左右，綠原酸提取率達(dá)到最大值。

圖1 乙醇濃度與溶劑體積對(duì)綠原酸提取率影響等高線圖

圖2 乙醇濃度與溶劑體積對(duì)綠原酸提取率影響3D響應(yīng)面圖

圖3 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率影響等高線圖

圖4 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率影響3D響應(yīng)面圖

圖5 提取時(shí)間與溶劑體積對(duì)綠原酸提取率影響等高線圖

圖6 提取時(shí)間與溶劑體積對(duì)綠原酸提取率影響3D響應(yīng)面圖

2.2.4 金銀花中綠原酸最佳提取工藝條件 結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，金銀花中綠原酸的最佳提取工藝參數(shù)：乙醇濃度為75.53%，溶劑體積為17.06倍，提取時(shí)間為82.83min。綠原酸理論提取率為1.8025%。考慮到實(shí)際生產(chǎn)情況，將各因素條件取整確定最佳提取工藝條件為：17倍量76%乙醇提取83min。對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，綠原酸提取率為：1.8245%，1.7868%，1.7954%，1.7805%，1.7801%，平均提取率為1.7935%，RSD為1.03%(n=5)，說(shuō)明該模型可靠。

3 討論

Box-Behnken 效應(yīng)面法是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外藥學(xué)工作者常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，適用于多因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。它采用數(shù)學(xué)建模的方法，擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析以尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，從而解決正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)無(wú)法精確得到最佳點(diǎn)，以及不能靈敏地考察各因素的交互作用等缺點(diǎn)。與中心復(fù)合設(shè)計(jì)法相比，Box-Behnken 效應(yīng)面法具有試驗(yàn)次數(shù)少的特點(diǎn)，從而節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

本文以綠原酸提取率為量化指標(biāo)，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)金銀花提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終確定其最佳提取條件。在最佳條件下，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值比較吻合，相對(duì)偏差較小。表明Box-Behnken效應(yīng)面法在金銀花提取工藝應(yīng)用中的可行性。本研究為中藥提取工藝的優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)參考。

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