免疫膠體金法與培養方法檢測沙門氏菌檢測結果研究

劉景武 付素蘭 任天紅 張榮 張蕊 孫文澤

·論著·

免疫膠體金法與培養方法檢測沙門氏菌檢測結果研究

劉景武 付素蘭 任天紅 張榮 張蕊 孫文澤

目的評價自制沙門氏菌膠體金試紙對沙門氏菌檢測的真實性、可靠性和實用性．探討其用于沙門氏菌引起的食物中毒臨床標本的快速檢測的應用價值。方法用培養法作為金標準，并用膠體金方法對同一份標本進行檢測，對膠體金方法的診斷試驗的評價指標作出計算。結果兩種方法的檢測結果之間有極好的一致性(Φ=0.903，Kappa=0.898)，膠體金法診斷沙門氏菌與金標準方法的差異無統計學意義(P>0.05)，膠體金法檢測沙門氏菌診斷試驗的靈敏度為81.8%，特異性為100%，符合率為99.6%，陽性預測值為100%，陰性預測值為99.6%，假陰性率為18.2%，假陽性率為0。結論膠體金法在基層、和突發公共衛生事件時，在對沙門氏菌檢測工作中具有一定的應用價值．該方法的特異性高，一致性也較高，但其靈敏度仍有待提高。

沙門氏菌；免疫膠體金；培養；診斷試驗

沙門氏菌是腸桿菌科中的一個重要菌屬，是人和動物的常見病原菌。可引起人類多種疾病，如食物中毒、胃腸炎、菌血癥、腸熱癥等。目前，對于沙門氏菌有很多檢測方法，如免疫學方法、分子生物學方法、以及傳統的金標準培養方法。但是，在應對突發公共衛生事件時，快速準確的判斷病原菌，成為診療的關鍵。雖然傳統的沙門氏菌檢測方法本身證明是可靠的，但卻很費力、耗時，需要4～7 d才能完成。而近幾年發展起來的膠體金免疫快速檢測法，是利用抗體膠體金標記技術和膜層析技術研制而成，用于定性檢測標本中的沙門氏菌。該法操作簡單，檢測結果清晰，易于判斷，可廣泛應用于臨床和基層醫療單位對可疑沙門氏菌標本的快速檢測[1-4]。為了探討快速法在臨床標本中的使用價值，我們對自制的沙門氏菌免疫膠體金試紙條與培養方法進行比較，并對檢測結果進行分析，以確定其在沙門氏菌引起腹瀉的診斷價值，以滿足臨床需要。

1 材料與方法

1.1 試劑 SS、EMB購自購自北京市陸橋技術有限公司。沙門氏菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業有限公司。細菌生化鑒定板購自珠海迪爾生物工程有限公司。細菌生化鑒定儀購自珠海迪爾生物工程有限公司。沙門氏菌免疫層析條由本實驗室自制。

1.2 標本 標本為2011年5月至 2012年10月間，我院門診和病房腹瀉患者糞便標本共520例。其中男性患者300例,女性220例；年齡7～75歲,平均年齡35歲。

1.3 方法

1.3.1 培養方法：取糞便標本接種到SS、EMB培養基上，35℃培養18～24 h，挑取可疑菌落，分離純化，同時做初步鑒定，同時用沙門氏菌多價血清(A-F)群進行分群，最后用純化的菌做生化鑒定，用沙門氏菌診斷血清鑒定到種。

1.3.2 沙門氏菌免疫層析條檢測[5-7]：取1 g(1 ml)標本加9 ml0.9%氯化鈉溶液混勻，500×g離心5 min。吸取上清液加入另一滅菌離心管中以14 000×g，離心10 min，沉淀用500 ml0.9%氯化鈉溶液懸浮 。在沸水中煮沸半小時。然后再用沙門氏菌免疫層析條檢測。實驗設陰陽性對照，以生理鹽水為陰性對照，結果判讀，檢測線和質控線同時出現為陽性，只出現質控線，為陰性，只出現檢測線，而無質控線，需重做。用培養的方法和免疫膠體金法同時對520例標本進行檢測，以培養法為標準，對檢測結果進行對比分析。

1.4 統計學分析 應用SPSS 19.0統計軟件，用四格表評價免疫膠體金法檢測的敏感性、特異性和準確性，計數資料采用χ2檢驗比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 用培養的方法和免疫膠體金法同時對520例標本進行檢測，其中培養的方法檢出11例陽性標本,509例陰性標本,而用免疫膠體金法檢測出9份陽性標本, 511例陰性標本。見表1。

獨立性檢驗(pearsonx2檢驗)結果：N=520，pearsonx2=94．214，P=0.000，兩種沙門氏菌檢測方法的結果不獨立，說明兩種檢測方法所得結果之間具有關聯性，其列聯系數中為0.903，可認為兩種檢測結果之間存在正關聯性；Kappa值為0.898，表明兩種方法的檢測結果之間的一致性為優。

表1 免疫膠體金法檢測的結果與培養方法比較

配對設計的Mc Nemerx2檢驗結果Mc Nemerx2P值為0.500，因此認為膠體金法診斷沙門氏菌與金標準方法檢測結果之間的差異沒有統計學意義。

2.2 常用診斷試驗評價指標的計算結果 自制沙門氏菌免疫膠體金試紙條的特異性為100%，靈敏度為81.8%。Youden指數越接近1，說明其診斷價值越大，本試劑的Youden指數為 81.8%，說明其診斷價值比較高。該試紙條與培養方法相比符合率達到99.6%。見表2。

表2 膠體金法診斷沙門氏菌試驗的評價指標

3 討論

通過實驗可知自制沙門氏菌膠體金試紙條與培養方法相比較其診斷的靈敏度為81.8%，特異性為100%，假陽性率為0；假陰性率為18.2%，符合率達到99.6%。

目前，對于沙門氏菌有很多檢測方法，如免疫學方法、分子生物學方法、以及傳統的金標準培養方法。但是，在應對突發公共衛生事件時，快速準確的判斷病原菌，成為診療的關鍵。雖然傳統的沙門氏菌檢測方法本身證明是可靠的，但卻很費力、耗時，需要4～7 d才能完成，已不能達到令人滿意的效果。分子生物學方法，雖然靈敏度高，可是操作繁瑣，技術性強，對人員要求嚴格，也不適合現場大規模應用，而免疫膠體金技術，以其操作簡單、檢測時間短、不需專業培訓就能滿足檢測的特點，非常適合突發公共衛生事件時，快速檢測目的。但是該方法靈敏度低，受方法學限制，從方法學上提高靈敏度，不太可能，所以在臨床標本檢測中，能不能通過建立一套前處理方法，以達到去除影響因子，提高靈敏度的目的呢？本研究使用自制沙門氏菌免疫膠體金試紙條，對糞便標本進行檢測，同時，實驗將密度梯度離心法和煮沸處理相結合，采用密度梯度離心法，去除了糞便中大部分的顆粒物，再經過煮沸處理，菌體破裂，暴露的抗體結合位點增多，并且顆粒變小后，在纖維素膜上的涌動速度變快，從而大大提高了陽性檢出時間和檢出限，整個檢測時間在一小時內完成，基本能滿足突發公共衛生事件的要求，達到快速、準確的檢測目的[10，11]。

膠體金方法作為一種免疫學方法具有快捷迅速，大大縮短出結果時間；操作簡便，不需任何儀器和設備；試劑穩定，外界因素影響較小；成本低廉，所需試劑和樣本量少的特點越來越受到科學家的關注，并成功應用于一些臨床檢測。但是在應用中也暴漏出一個問題，那就是通過計算發現膠體金法診斷沙門氏菌的靈敏度為81.8%，靈敏度則有待提高，容易造成漏診。所以在實際工作中只能做為輔助方法，不能代替培養的方法，在今后的工作中，我們將尋求改進的方法提高其靈敏度。

1 諶志強，段惠莉，王新為，等．大腸埃希菌O157：H7的膠體金免疫滲濾法檢測．中國公共衛生, 2005，21：705-706．

2 Duan HL，Shen ZQ，Wang XW，et al．Preparation of immunomagnetic iron-dextran nanoparticles and application in rapid isolation of E.coli O157 from foods．J World Journal of Gastroenterology，2005，11：3660-3664．

3 王中民，李君文，王新為，等．膠體金免疫層析法快速檢測沙門氏菌.微生物學免疫學進展，2004，32：36-38．

4 唐景峰,李曉艷.布病膠體金免疫層析檢測方法的建立.中國生物制品學雜志,2007,20:119-122.

5 熊國華，于莉.單增李斯特菌免疫膠體金試紙條快速檢測.中國公共衛生,2008,24:248-249.

6 賈慧，田秀梅.膠體金快速法檢測糞便幽門螺桿菌分泌蛋白的臨床應用評價.吉林醫學,2009,30:2629-2630.

7 王璞，陳保文.斑點免疫金滲濾法檢測抗莢膜組織胞漿茵抗體的研究.第三軍醫大學學報,2007,29:1979-1981.

8 李少彤，欒玉明.膠體金法快速檢測霍亂弧菌診斷試驗的研究設計與分析.中國衛生檢驗雜志,2006,16:269-271.

9 許青田,崔中鋒.膠體金標記免疫層析法快速診斷霍亂臨床研究.中國誤診學雜志,2002,2:900-901.

10 劉景武，付素蘭，任天紅，等.沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條檢測腹瀉病人糞便中沙門氏菌的研究.中國衛生檢驗雜志，2014，24:66-67.

11 劉景武，付素蘭，任天紅，等.沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條的研制.河北醫藥，2013，35:3493-3494.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.024

050011 河北省石家莊市第三醫院檢驗科

R 378.22

A

1002-7386(2014)07-1021-02

2013-10-30)