改良冷配Schiff染液在腎穿刺活檢病理檢查中的應用

婁 巖，劉樹軍，高 丹，孫東晗，田向輝

(吉林大學第二醫(yī)院 腎病內(nèi)科,吉林 長春130041)

腎活檢穿刺術是在彩超引導下經(jīng)皮腎臟組織穿刺，以了解腎臟組織形態(tài)學改變，為臨床醫(yī)生判斷病情、治療疾病和估計預后方面提供了重要的依據(jù)，腎臟病理檢查結果已經(jīng)成為腎臟疾病診斷的重要方法之一。過碘酸-雪夫氏(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)染色是腎穿刺活檢術中重要的染色方法之一，主要檢測腎臟組織中糖元和其它多糖物質(zhì)，顯示腎小球系膜區(qū)的范圍和基膜的厚度、腎小球內(nèi)某些滲出性蛋白、節(jié)段性硬化和結節(jié)性病灶等[1]。Schiff液是PAS染色的主要試劑成分，由于腎臟病理切片厚度為1-2 μm，較其他常規(guī)切片組織薄，著色相對困難，Schiff液存放時間稍久，其與腎臟組織糖類物質(zhì)著色能力下降，給臨床診斷造成一定的困難。為此筆者從2010年起，經(jīng)歷了1134例腎穿刺組織染色的摸索，改良了Schiff染液的配方，并將該配方與國內(nèi)傳統(tǒng)配方的染色效果進行對比，認為改良冷配Schiff染液法有更好的應用效果，不僅縮短PAS染色時間，同時也保證腎臟組織糖類物質(zhì)有效表達，滿足腎臟組織中糖類物質(zhì)定性和定量檢測的需要。

1 材料與方法

1.1儀器與藥品

儀器：磁力攪拌器，電子天平；藥品：堿性品紅，N鹽酸，偏重亞硫酸鈉，蒸餾水，活性炭。

1.2染液配制方法

1.2.1 Schiff染液的傳統(tǒng)熱配法 稱取堿性品紅1 g加入剛煮沸的盛有200 ml蒸餾水的三角燒瓶中，搖動數(shù)分鐘使之徹底溶解，冷卻至50℃后過濾，加入1N鹽酸20 ml，再冷至25℃時，加入1-1.5 g偏重亞硫酸鈉，密封三角燒瓶口振蕩器震蕩使之全部溶解，于暗處靜置24 h后變成稻草色，加入活性碳1-1.5 g，振搖1-2 min，過濾至無色透明，置于0-4℃避光保存[2]。

1.2.2 Schiff染液的傳統(tǒng)冷配法 稱取堿性品紅1 g入蒸餾水400 ml,用磁力攪拌器攪拌2.5-3 h至完全溶解，繼續(xù)加入1N鹽酸40ml攪拌至暗紅色,再加入偏重亞硫酸鈉3 g，攪拌2.5-3 h至草黃色，然后室溫下靜置12 h，加入1 g活性炭，攪拌1 min后過濾至無色透明，置于0-4℃避光保存。

1.2.3 Schiff染液的改良冷配法 稱取堿性品紅6 g入蒸餾水420 ml，用磁力攪拌器攪拌2.5-3 h至完全溶解，繼續(xù)加入1N鹽酸80 ml和偏重亞硫酸鈉10 g混合，攪拌2.5-3 h至草黃色，黑暗室溫靜置12 h后再加入5 g活性炭，攪拌后過濾至無色透明，置于0-4℃避光保存。

1.3PAS染色方法

(1)1134例蠟塊切片厚度為1 μm，腎臟病理切片常規(guī)脫蠟至水；(2)1%高碘酸氧化10-15 min，流水沖洗1 min；(3)Schiff染液避光滴染后，流水沖洗5 min；(4)Harri 明礬蘇木素液染核3-5 min，流水沖洗2 min；(5)1%鹽酸乙醇分化10 s左右，流水沖洗2 min，弱氨水返藍10 s左右，流水沖洗2 min；(5)系列乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

2 結果

2.1 相同環(huán)境和時間條件下，應用3種不同方法配制的Schiff液所染的腎組織PAS染色如圖1，對腎組織的腎小球和腎小管基底膜、細胞漿、腎小球系膜基質(zhì)、膠原纖維、血管及血管玻璃樣變等部位著色鮮艷程度和陽性部位清晰程度對比發(fā)現(xiàn)：應用改良冷配法Schiff液染的PAS染色糖元和其它多糖物質(zhì)著色力強，顏色鮮艷，背景清晰，與陰性成分區(qū)分明顯，定位準確。即改良冷配法(圖1A)優(yōu)于傳統(tǒng)熱配法(圖1B)和傳統(tǒng)冷配法(圖1C)。

2.2 在PAS染色過程中應用改良冷配法的腎組織標本完全著色耗時約為5-10 min，傳統(tǒng)熱配法的腎組織標本完全著色耗時約為20-40 min，傳統(tǒng)冷配法的腎組織標本完全著色耗時約為30-60 min，改良冷配法腎組織標本完全著色時間明顯少于傳統(tǒng)熱配法和傳統(tǒng)冷配法。如圖2，改良冷配法(圖2D)的腎組織標本陽性部位比傳統(tǒng)熱配法(圖2E)和傳統(tǒng)冷配法(圖2F)著色力強、定位準確，并且提高染色效率，保證Schiff染液與糖原充分反應。

A：改良冷配法；B：傳統(tǒng)熱配法；C：傳統(tǒng)冷配法

D：改良冷配法；E：傳統(tǒng)熱配法；F：傳統(tǒng)冷配法

2.3 改良冷配法無需加熱，操作簡單，節(jié)約時間，避免溫度和時間掌控不準確而影響配制效果；傳統(tǒng)冷配法配制耗時略少于改良冷配法，但腎組織標本完全著色耗時較長，陽性部位顏色與背景色區(qū)分不清晰，影響工作效率；傳統(tǒng)熱配法配制耗時長，溫度要求較嚴，穩(wěn)定性較差，復用效果不佳，冷卻后易析出雜質(zhì)(見表1)；隨著儲存時間延長，改良冷配法Schiff液著色能力和時間沒有明顯變化，而傳統(tǒng)冷配法和傳統(tǒng)熱配法著色能力下降明顯，組織染色較淡，染色時間變長，如圖3，同一時間分別用改良冷配法(圖3G)、傳統(tǒng)熱配法(圖3H)和傳統(tǒng)冷配法(圖3I)配制的Schiff液六個月后所染的腎組織情況比較。

表1 Schiff染液的配制方法比較

G：改良冷配法；H：傳統(tǒng)熱配法；I：傳統(tǒng)冷配法條件

3 討論

改良冷配法與傳統(tǒng)冷配法是在室溫下采用振蕩或攪拌的方法來增加分子之間的碰撞，促進染料的溶解與脫色，傳統(tǒng)熱配法通過加熱促進分子的布朗運動進而加速染料的溶解與脫色，二者作用機制相同[3]。腎臟病理檢查具有特殊性，為了能更好顯示腎臟病理變化，要求切片厚度為1 μm左右，切片較薄容易致使腎臟組織切片著色困難，同時PAS染色顏色反應的深淺取決于乙二醛基多寡，因此為了能夠充分氧化多糖的乙二醇基變?yōu)橐叶┗緦嶒灢捎醚趸瘎?%高碘酸(HIO4)，組織中氧化生成的醛基與Schiff試劑結合后即呈現(xiàn)出紫紅色反應產(chǎn)物而得到定位[4]。Schiff染液隨著儲存時間延長部分偏重亞硫酸鈉會被消耗掉，堿性品紅與亞硫酸鹽結合成不穩(wěn)定的無色物質(zhì)轉(zhuǎn)化為二氧化硫逸出，致使著色能力逐漸下降[5]，為了避免此種弊端，改良冷配法分別將偏重亞硫酸鈉和堿性品紅的濃度提高到0.02 g/ml、0.012 g/ml。

經(jīng)過長時間的驗證，改良冷配Schiff染液較傳統(tǒng)熱配法和傳統(tǒng)冷配法使用周期長、染色時間短、試劑穩(wěn)定性好、無雜質(zhì)。改良冷配法Schiff染液著色能力較強，較好地顯示腎小球毛細血管和腎小管的破壞、皺縮、增厚程度；腎小球系膜細胞及基質(zhì)增生的情況；高血壓病細動脈壁內(nèi)沉積的蛋白質(zhì)和玻璃樣變；各種炎性細胞浸潤程度等，與陰性成分區(qū)分明顯、定位準確，并且在染色的過程中不會出現(xiàn)沉渣。

在工作中為保證PAS染色效果，Schiff液4℃冰箱內(nèi)冷貯備用，使用之前45 min取出恢復至室溫；避免Schiff液與空氣接觸，以防氧化變色；Schiff液配制和染色過程中所用的玻璃器皿須干燥、清潔，因無色堿性品紅液遇自來水則變紅色[6]。

綜上所述，改良冷配Schiff染液法較傳統(tǒng)熱配法和傳統(tǒng)冷配法更適合腎穿刺活檢組織切片的PAS染色，有助于臨床病理診斷，值得推廣應用。

作者簡介：婁巖(1985-)，男，碩士學位，技師，主要從事腎臟病理研究。

參考文獻：

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[6]田玉旺，李 琳，朱紅艷，等．失效Schiff液的再利用[J]．診斷病理學雜志，2009，16(5)：390．