EGF與Gastrin聯合應用對糖尿病大鼠胰島β細胞再生的影響

孟召祥，孫中華，張媛媛，劉靜秋，楊 麗，高 靜，倪勁松*

(1.吉林省人口生命科學技術研究院，吉林 長春130041；2.吉林大學第一醫院 內分泌科；3.吉林大學人獸共患病教育部重點實驗室人獸共患病研究所；4.吉林省產品質量監督檢驗院；5.吉林大學第一醫院 病理科)

表皮生長因子(EGF)是肽類生長因子，許多研究證明，EGF參與體外誘導干細胞向胰島樣細胞分化。已有文獻證實Gastrin是一種介導胰島新生的生長因子[1]，觀察轉導胰島素啟動子調控Gastrin基因的小鼠，雖然沒有觀察到實驗組小鼠胰島細胞數量的變化，但表達TGF、Gastrin的胰島細胞數增多。在大鼠的胰腺導管結扎模型中發現Gastrin可促進胰島β細胞再生，推測可能在該模型中，外源性的Gastrin可能是促進胰島β細胞再生必要因子[2]。本文通過聯合應用Gastrin、EGF，觀察Gastrin、EGF對糖尿病大鼠胰島β細胞增殖作用影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設備

STZ和Heochest33342為Sigma公司產品；兔抗PDX-1抗體為Santa Cruz公司產品；鼠抗Insulin抗體為北京博奧森公司產品；Alexa Fluor 555標記的山羊抗兔IgG 和Alexa Fluor 488標記的山羊抗鼠IgG、EGF為 Invitrogen 公司產品；Insulin為江蘇萬邦生化醫藥有限公司產品；Gastrin為GenScript Corporation產品；Fluview 1000激光掃描共聚焦顯微鏡為Olympus公司出品，切片機為德國Leica公司。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

Wistar雄性大鼠45只，體重180 g-220 g，隨機分成2組，正常對照組10只，實驗組35只。給予正常對照組大鼠腹腔注射pH4.0枸櫞酸鈉緩沖液，對實驗組大鼠進行腹腔注射STZ-枸櫞酸鈉緩沖液，注射劑量為35 mg·kg-1，每周1次，連續4周。所有大鼠按時尾靜脈采血測血糖，根據血糖值≥ 11.1 mmol·L-1及尿糖≥ +++確定成模標準。

1.3 實驗分組

將實驗組成模大鼠隨機分為三組，即：Insulin治療組10只，給予長效胰島素2U/d，連續14日；EGF/Gastrin聯合治療組10只，皮下注射EGF(1 μg·kg-1) /Gastrin (3 μg·kg-1)，連續14日；DM對照組9只，對 DM對照組和正常對照組，均給予pH8.0 Tris-HCl緩沖液，實驗結束后留取胰腺標本進行實驗觀察。

1.4 免疫熒光雙染色

常規免疫組化制片，用5%山羊血清封閉30 min，滴加一抗組合，過夜(PDX-1與Insulin)，0.01%Triton洗3遍，每次洗滌5min，滴加雙二抗(Alexa Fluor 555標記的山羊抗兔IgG 和Alexa Fluor 488標記的山羊抗鼠IgG)，常溫下避光放置1 h，0.01% Triton洗3遍，5 min/次，Hoechest復染核，PBS洗1次，10 min甘油封片。

1.5 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析，將各組間數據根據單因素方差分析方法比較后，使用q檢驗，當P<0.05認為有統計學差異。

2 結果

2.1 糖尿病大鼠血糖變化

實驗組35只大鼠中，33只大鼠血糖值≥11.1 mmol·L-1，占總數的約94%，其中，29只實驗組大鼠的空腹血糖值為15.6±3.01 mmol·L-1，與正常對照組相比明顯增高。

2.2 EGF/Gastrin聯合應用對糖尿病大鼠血糖的影響

DM組大鼠血糖值隨時間推移變化比較大，平均值為20.3±3.78 mmol·L-1，最高值26.1 mmol·L-1。胰島素組10只大鼠的平均血糖值8.0±4.38 mmol·L-1，有8只大鼠血糖值低于11.1 mmol·L-1，其中6只大鼠血糖值低于7.8 mmol·L-1，與模型組相比有明顯降低(P<0.05)。EGF/Gastrin組中平均大鼠血糖值11.2±6.43 mmol·L-1，有6只大鼠血糖值低于11.1 mmol·L-1，其中有5只大鼠血糖值低于7.8 mmol·L-1。EGF/Gastrin組大鼠的血糖值和DM組大鼠的血糖值相比可見顯著降低(P<0.05)，但是仍高于正常對照組和胰島素組(表1)。

2.3 PDX-1在胰腺組織中的表達及與Insulin表達的關系

對胰島組織進行了PDX1和Insulin染色。結果發現，在正常對照組中，PDX-1陽性表達在胰島部分β細胞的細胞核中出現。DM組大鼠胰島僅見微量Insulin和PDX-1表達。EGF/Gastrin治療組和Insulin治療組在胰島組織的周邊見PDX-1陽性細胞，并存在PDX-1與Insulin共表達的細胞。與正常的β細胞相比，這些PDX-1陽性細胞的Insulin著色較弱(圖1)。

表1 實驗大鼠實驗結束后的空腹血糖值

注：DM組在處死前有1只大鼠死亡；*DM組與正常對照組相比；**Insulin組與DM組相比；***EGF/Gastrin組與DM組相比。

3 討論

以往的研究證實，在胰腺發育過程中EGF起一定作用，并且發現大鼠胚胎胰腺導管能被EGF受體信號促進生成[3]，胰腺導管形成過程受破壞或胰島細胞分化障礙是由于EGF受體缺乏導致的[4]。在胰腺發育中的次級轉變時期出現有活性的內源性Gastrin的表達[5]。在實驗中我們進行研究的對象為血糖值≥11.1 mmol/L的糖尿病大鼠，持續給以外源性Gastrin和EGF，觀察二者聯合應用對糖尿病大鼠胰島β細胞再生的影響。

A.為正常組；B.為DM組;C.為Insulin治療組;D.為EGF/Gastrin治療組Insulin的綠色熒光染色位于細胞質；PDX-1的紅色熒光染色位于細胞核

PDX-1是目前較為公認的胰島前體細胞分子標志，是胰腺定向發育成熟過程中第一個已知的也是最為重要的轉錄因子。PDX-1能促進胰島β細胞增殖并抑制細胞凋亡，通過調控Insulin和Insulin相關基因，用來促進Insulin的分泌以維持胰島β細胞的正常生理功能。為了確定增多的β細胞數量是否是β細胞增殖的結果，我們檢測了EGF/Gastrin組大鼠的胰腺的β細胞中的的PDX-1蛋白表達。我們的實驗結果證實胰島中增多的β細胞并不是殘存的β細胞增殖所形成的，而是由其它的細胞再生分化的結果。胚胎發育時期，胰腺導管細胞轉變為胰島β細胞是由PBX與PDX-1基因共同作用來促進的。胰腺大部分被切除后，PDX-1表現顯著促胰腺細胞增殖的作用，該表現類似于胚胎發育的胰腺形成過程[6]。我們在實驗中觀察到，EGF/Gastrin組大鼠的胰腺出現了共表達胰島素細胞，胰島周邊存在PDX-1陽性細胞。這些細胞胰島素表達比正常β細胞弱、顯顆粒狀、熒光強度較弱。推測這些細胞是處于由胰島前體細胞向胰島素分泌細胞分化過程中。我們給予外源性Insulin及EGF與Gastrin聯合進行治療后大鼠血糖明顯降低，且部分血糖恢復到正常水平。治療后PDX-1胰島素前體細胞在大鼠胰島組織中表達，且這些細胞能表達胰島素，表現向胰島素分泌細胞分化的趨勢。但EGF與Gastrin對β細胞再生的影響，是否是EGF和Gastrin直接作用導致了胰島前體細胞的出現并促使其發生分化，亦或是通過降低血糖而間接發揮作用尚無法確定。另外，有關EGF與Gastrin促進β細胞再生是通過胰島內細胞化生,還是來源于胰腺導管中存在的胰島前體細胞，有待進一步的研究證實。

參考文獻：

[1]Téllez N,Joanny G,Escoriza J,et al.Gastrin treatment stimulates β-cell regeneration and improves glucose tolerance in 95% pancreatectomized rats[J].Endocrinology,2011,152(7):2580.

[2]Brand SJ,Tagerud S,Lambert P,et al. Pharmacological treatment of chronic diabetes by stimulating pancreatic beta-cell regeneration with systemic co-administration of EGF and gastrin[J].Pharmacol Toxicol,2002,91(6):414.

[3]Sj?holm A,Sandberg E,Ostenson CG,et al.Peptidergic regulation of maturation of the stimulus-secretion coupling in fetal islet beta cells[J].Pancreas,2000,20(3):282.

[4]Miteeinen PJ,Huotari M-A,Koivisto T,et al.Impaired migration and delayed differentiation of pancreatic islet cells in mice lacking EGF-receptors [J].Development,2000,127:2617.

[5]Brand SJ,Fuller PJ.Differential gastrin gene expression in rat gastrointestinal tract and pancreas during neonatal development[J].Biol Chem,1988,263:5341.

[6]孫吉平,楊于嘉,王曉莉,等.胰腺十二指腸同源框-1基因促進大鼠骨髓間充質干細胞分化為胰島樣細胞[J].中國科學 C輯 生命科學,2006,36(2):171.