β-二酮的鈷配合物的急性毒性實驗研究

張開治，呂 錚，高 鍵，劉俊志*，崔樹森

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033； 2.吉林大學第一醫院)

隨著多學科協作、合作的不斷深入，醫學與化學交織，利用各種新型化合物解決醫學難題的研究層出不窮，順鉑作為典型的無機抗腫瘤藥，廣泛的應用于腫瘤治療，但存在副作用[1]。改進結構后具有新配基的鉑復合物在臨床試驗中并未顯示出顯著的優勢，至今只有Carboplatin和Oxaliplatin投入臨床[2，3]，非鉑金屬化合物的研究因此逐漸受到重視。鈷是一種高熔點、穩定性良好的磁性硬金屬，在探討含鈷化合物的抗腫瘤活性研究進展中，我們發現多種含鈷配合物都對腫瘤細胞表現出明顯的抑制作用。Jensen于1959年合成的β-二酮螯合劑具有廣泛的螯合能力，并且對金屬具有良好的螯合作用[4]，近年來對其抑制超氧負離子自由基O2-能力的發現，將其引入了醫學領域。

東北師范大學王曉紅課題組和吉林大學李銳課題組成功合成了2，4-戊二酮的鈷、鉬配合物[Co(acac)2(H2O)2和Mo(acac)2O2]，并用實驗證明了該配合物對實體瘤細胞SMMC-7721和SK-OV-3的抑制作用。其實驗結果表明，2，4-戊二酮鈷的抗腫瘤活性高于2，4-戊二酮鉬[5]。本實驗選用抗腫瘤活性高的2，4-戊二酮鈷為研究對象進行急性毒性實驗研究，為可能的新型抗腫瘤藥物研發做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

β-二酮鈷的配合物由東北師范大學多酸化學研究所合成。DMSO，蘇木精和伊紅(Sigma公司，美國)，其余常規試劑購自北京化工廠。昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22 g，由吉林大學動物實驗中心提供，合格證號(吉)2008-0005。精密電子天平(Sartorius公司，德國)，Olympus BX50倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)，電熱恒溫干燥箱(湖北省黃石市醫療機械廠，中國)， TISSUE—TEKVIP TEC 包埋機(LEICA公司，德國)，脫水機(LEICA公司，德國)，切片機SM 2000R(LEICA公司，德國)。

1.2 急性毒性試驗

1.2.1 預備試驗方法 采用等體積不等濃度一次性灌胃給藥，灌藥前先按需要用溫超純水將 β-二酮的鈷配合物溶解，配置成不同濃度的溶液，然后再稱量每只小鼠的體重，根據體重灌胃給藥，給藥體積為0.2 ml/10 g體重。灌藥前禁食 24 h，只提供充足的清潔飲水。預實驗選取小鼠12 只，每組 4 只，起始給藥量為3 500 mg/kg體重。給藥組4 只小鼠全死則降低劑量一半，未全死則增加劑量一倍，則按 2∶1 的比例向上、向下調整劑量，找出上下限劑量Dm 及Dn。

1.2.2 正式試驗方法 選取體重(18-22)g，雌雄各半小鼠 80 只，禁食不禁水 16 h后稱重標號，按隨機數字表，隨機分成8組，每組10只(5只雄性，5只雌性)，分籠飼養。采用等體積不等濃度一次性灌胃給藥，灌胃量為 20 ml/kg 體重，給藥劑量為 7000、4900、3430、2401、1680、1176、823 mg/kg 體重。灌胃后再禁食4 h，每天觀察3次，連續觀察 14 天，記錄小鼠的中毒表現及死亡動物的數量和時間，并于給藥后 7天、14天稱重。根據所得試驗數據，采用 Bliss 法計算小鼠的半數致死劑量 LD50以及 LD50的 95%可信限(使用急性毒性實驗-LD50的 BLISS 運算軟件)。

1.3 蘇木精 — 伊紅染色法

對上述不同劑量組的死亡小鼠進行系統的尸體解剖，14天試驗完畢后，對存活小鼠亦逐一進行剖檢。急毒試驗小鼠臟器切片經二甲苯(Ⅰ)，二甲苯(Ⅱ)脫蠟各15 min，二甲苯/無水乙醇(1∶1)2 min，無水乙醇(100%)5 min，75%乙醇5 min，蒸餾水5 min后，依次在蘇木精染色液浸泡5 min，氨水5 s，蒸餾水洗5 s。再經伊紅染色液浸泡3 min，后進入固定。75%乙醇5 min，無水乙醇(100%)5 min，二甲苯(Ⅰ)，二甲苯(Ⅱ)各5 min后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 β-二酮鈷的配合物急性毒性上下限測定

在預實驗中，β-二酮鈷的配合物先以3 500 mg/kg體重灌胃給藥，4只小鼠有3只死亡，死亡時間在5 h到12 h之間。隨后以7000，1750，875和437.5 mg/kg體重灌胃給藥，結果7000 mg/kg體重組4只小鼠全部死亡，時間在1-4 h之間。875 mg/kg體重及以下組未出現小鼠死亡(見表1)。由此測出的 Dm 為 875 mg/kg 體重，Dn為7 000 g/kg 體重。

2.2 β-二酮鈷的配合物急性毒性試驗及LD50測定

β-二酮鈷的配合物給藥后 1 h開始出現死亡，死亡前小鼠出現昏睡、皮毛無光澤、體重減輕等中毒癥狀；12 h后存活小鼠不再死亡，存活24 h后的小鼠生理狀態良好未見異常。14天試驗結束，進行統計分析，測定β-二酮鈷的配合物的半數致死量LD50為 3099.1 mg/kg 體重，LD5為1046.8 mg/kg，LD95為9174.9 mg/kg，LD50的95%可信限為 2428.2-4100.1(見表2)。

表1 β-二酮鈷的配合物急性毒性上下限測定

表2 Bliss法測定β-二酮鈷的配合物灌胃給藥LD50

注：回歸方程 y(Probit)=-7.1832+3.489Log(D)，LD50=3099.1mg/kg，LD50(Feiller校正)95%的可信限=2428.2-4100.1，LD5=1046.8 mg/kg LD95=9174.9mg/kg

2.3 病理剖檢和組織學觀察

對受試小鼠進行解剖觀察，β-二酮鈷的配合物給藥實驗組與對照組相比，肝腎未見明顯異常，腸道局部可見水腫、灶狀壞死、出血。鏡下病理觀察，可見實驗組腎臟未見異常改變，實驗組肝臟可見輕、中度肝細胞變性，偶見匯管區淋巴細胞，灶狀肝細胞壞死，散在肝細胞再生；可見實驗組腸道腸黏膜炎癥，局部腺體壞死，腸腔炎性滲出(見圖 1)。

3 討論

急性毒性試驗是研究和認識化學物毒性的第一步工作，目的在于測定和計算出受試化合物的致死劑量及其他急性毒性參數，研究受試物在動物體內的動力學變化規律，確定安全性與毒性后，再進行進一步的開發研究，最后在毒副作用和療效上做出評價判斷有無開發價值。急性毒性試驗是藥物開發的必備檢測和前提。在先前的體外實驗研究中，東北師范大學王曉紅課題組和吉林大學李銳課題組已證實該配合物對實體瘤肝癌SMMC-7721細胞株和卵巢癌SK-OV-3細胞株有明顯的抑制作用，故該藥物具有成為新型抗腫瘤藥物的可能。急性毒性實驗為其進一步開展體內實驗提供實驗參考，為其作為抗腫瘤新藥研發提供必要前提，決定其能否進行臨床試驗或進入市場。

圖1 β-二酮鈷的配合物給藥后病理切片HE染色

我們研究發現β-二酮鈷的配合物抗腫瘤機理與細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡相關，但是缺乏β-二酮鈷配合物急性毒性資料。測定LD50的95%可信區間為2428.2-4100.1 mg/kg，LD50為3099.1 mg/kg。依據外來化合物毒性分級標準，小鼠一次經口半數致死劑量在1001-10000 mg/kg之間的屬于低毒物質[6]，判定β-二酮的鈷配合物屬于低毒化合物，可以

進行進一步的抗腫瘤藥物的研發。隨著給藥劑量增加，中毒癥狀也越明顯，死亡數量越多，呈明顯的劑量-效應關系。進一步實驗中，為確保每次實驗成功，需注意單次給藥劑量。病理剖檢和組織學切片觀察發現，實驗組腎臟未見明顯異常，肝臟及腸道均呈現炎性改變，且改變程度與劑量相關。由此推斷該化合物腎損害小，腸道及肝臟為急性中毒的主要靶器官，肝臟損害可能存在一過性肝損害可能。病理結果也提示出可在β-二酮的鈷配合物給藥的同時，給予腸道黏膜保護劑及抑酸藥物，從而減少毒性作用。

參考文獻：

[1]Dempke W,Voigt W,Grothey A,et al.Cisplatin resistance and oncogenes-a review[J].ANTI-CANCER DRUGS,2000,11(4)：225.

[2]Kelland L.The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy[J].Nat Rev Cancer,2007,7(8):573.

[3]Misset JL,Bleiberg H,Sutherland W,et al.Oxaliplatin clinical activity:a review[J].Crit Rev Oncol Hematol,2000,35(2):75.

[4]Jensen B S.The synthesis of phenyl-3-methyl-4-acylpyrazolone-5[J].Acta Chem Scand,1959,13:1668.

[5]Zhang K,Cui S,Wang J,et al.Study on antitumor activity of metal-based diketone complexes[J].Medicinal Chemistry Research,2012,21(7):1071.

[6]Lipnick RL,Cotruvo JA,Hill RN,et al.Comparison of the up-and-down,conventional LD50,and fixed-dose acute toxicity procedures[J].Food Chem Toxicol 33(3):223.