TPCA-1對脂多糖誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞作用及其機(jī)制的研究

姜 宏,仲 煒,閆東君

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 眼科,吉林 長春130033)

通過研究TPCA-1影響LPS刺激角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子(IL-1,TNF-α,IL-6)和趨化因子(IL-8)以及細(xì)胞表面ICAM-1中的作用，旨在觀察TPCA-1對脂多糖誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞間黏附因子抑制作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,為臨床治療角膜潰瘍提供有益的線索。

1 材料與方法

1.1人角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定組織來源于角膜移植術(shù)后剩余角膜材料,供體為健康成年人。采用消化培養(yǎng)法,用小鼠抗人波形蛋白及角蛋白單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.2ELISA法檢測角膜基質(zhì)細(xì)胞LPS作用前后培養(yǎng)上清中分泌IL-1,TNF-α,IL-6,IL-8水平分組為:① 陰性對照組:加入不含有任何血清或藥物的同體積MEM培養(yǎng)液；② 溶媒對照組:單純給予含有0.5%人血清(AB型)的MEM培養(yǎng)液；③LPS組:給予含有0.5%人血清(AB型)及LPS 100 ng/ml的MEM培養(yǎng)液。

1.3ELISA檢測不同濃度的TPCA-1對LPS作用前后分泌IL-6,IL-8蛋白的作用ELISA檢測試劑盒按說明書操作。并根據(jù)此結(jié)果進(jìn)行下一步試驗。

1.4蛋白質(zhì)印跡雜交(Westernblot)法檢測TPCA-1對LPS作用后細(xì)胞IL-6,ICAM-1的影響分組為:①陰性對照組:給予等體積MEM培養(yǎng)液；②LPS組:給予含有0.5%人血清(AB型)的LPS(100 ng/ml)；③TPCA-1組:給予TPCA-1(1.0 μM)預(yù)處理1小時后,給予含有0.5%人血清(AB型)的LPS(100 ng/ml)。

以上3組各自作用24 h后,提取細(xì)胞中總蛋白,進(jìn)行蛋白含量的測定,蛋白質(zhì)印跡雜交,將Westem印跡雜交X線片圖像掃描入計算機(jī),采用Quanty one軟件進(jìn)行定量分析。

1.5逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測TPCA-1LPS刺激前后細(xì)胞IL-6,IL-8,ICAM-1的影響分組同1.4。PCR使用的引物包括:① GAPDH:上游5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’ ,下游5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’,用這對引物可擴(kuò)增出長度為447 bp的GAPDH cDNA片段； ② IL-6:(+)5′-GGA GAC TTG CCT GGT GAA-3′,(-)5′-CTG AGG TGC CCA TGC TAC-3′,用這對引物可擴(kuò)增出長度為330 bp的IL-6 cDNA片段； ③ IL-8:(+)5′-ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT-3′,(-)5′-TCT CAG CCC TCT TCA AAA ACT TCT C-3′,用這對引物可擴(kuò)增出長度為293 bp的ICAM-1cDNA片段。 ④ ICAM-1:(+)5′-TGA CCA GCC CAA GTT GTT GG-3′,(-)5′-ATC TCT CCT CAC CAG CAC CG-3′,用這對引物可擴(kuò)增出長度為380 bp的ICAM-1cDNA片段。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴化乙錠)3 V/cm電泳30-50 min,紫外燈下照相,用凝膠成像處理系統(tǒng)對每一樣品PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片斷(IL-6、IL-8、ICAM-1和GAPDH)進(jìn)行輝度掃描,以GAPDH密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn),標(biāo)本目的基因條帶的光密度參數(shù)與內(nèi)參基因GAPDH條帶的光密度參數(shù)之比值作為該標(biāo)本mRNA的相對定量。

1.6免疫組化染色檢測TPCA-1對LPS作用前后NF-κB的分布及表達(dá)實驗細(xì)胞的準(zhǔn)備及分組同1.5,免疫組化染色按試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1ELISA法檢測角膜基質(zhì)細(xì)胞LPS作用前后分泌IL-1,TNF-α,IL-6,IL-8水平各組均未檢測到IL-1、TNF-α,與陰性對照組比較,人血清組分泌IL-6、IL-8因子水平無顯著差異(P>0.05)；LPS組分泌IL-6、IL-8水平明顯高于陰性對照組(P<0.01)。

2.2ELISA檢測不同濃度的TPCA-1對LPS作用前后分泌IL-6,IL-8蛋白的影響在無LPS作用下,不同濃度的TPCA-1作用后IL-8的基礎(chǔ)分泌與陰性對照組比較無顯著差異(P>0.05)；IL-6的基礎(chǔ)分泌與陰性對照組比較明顯降低(P<0.05),作用隨TPCA-1濃度增加而增大,具有濃度依賴性。LPS作用后,各濃度的TPCA-1對IL-6、IL-8的影響與LPS組比較均有顯著差異(P<0.05),作用隨TPCA-1濃度增加而增大,具有濃度依賴性。

2.3蛋白質(zhì)印跡雜交(Westernblot)法檢測TPCA-1應(yīng)用對LPS作用后細(xì)胞IL-6,ICAM-1蛋白的影響陰性對照組表達(dá)IL-6及ICAM-1蛋白,LPS作用后表達(dá)水平增高,與陰性組比較有顯著性差異(P<0.01)。與LPS組比較,LPS+TPCA-1組能夠明顯抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞IL-6及ICAM-1的表達(dá)(P<0.01)。

2.4RT-PCR檢測TPCA-1應(yīng)用對LPS作用后細(xì)胞IL-6,IL-8,ICAM-1的影響陰性組mRNA水平表達(dá)IL-6、IL-8及ICAM-1,LPS作用后表達(dá)水平增高,與陰性組比較有顯著性差異(P<0.05)。LPS+TPCA-1組能夠明顯抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞IL-6、IL-8及ICAM-1在mRNA水平的表達(dá),與LPS組比較有顯著性差異(P<0.05)。

2.5免疫組化染色檢測TPCA-1應(yīng)用對LPS作用前后細(xì)胞核NF-κB表達(dá)細(xì)胞爬片行NF-κB免疫組織化學(xué)染色,可見正常培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞核呈深藍(lán)色,LPS作用后細(xì)胞核黃褐色陽性著染,TPCA-1抑制后給予LPS作用細(xì)胞核染色為深藍(lán)色陰性。

3 討論

角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞在角膜防御和炎癥反應(yīng)中有重要作用。這些細(xì)胞不僅通過對炎性細(xì)胞因子發(fā)生反應(yīng),還可以直接和細(xì)菌相互作用誘導(dǎo)炎性細(xì)胞局部浸潤。成纖維細(xì)胞依其所在身體的不同部位和局部刺激物而表現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)和功能特性[1],在離體培養(yǎng)后他們的不同表現(xiàn)型能夠維持不變[2，3]。角膜、皮膚、肺等不同組織來源的成纖維細(xì)胞細(xì)胞因子調(diào)節(jié)TARC表達(dá)是不同的[4,5],成纖維細(xì)胞對LPS的應(yīng)答反應(yīng)也因組織來源不同而不同。例如,肺成纖維細(xì)胞在LPS刺激時表達(dá)MCP-1而不表達(dá)IL-8[6],現(xiàn)在我們證實角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞在LPS刺激時則表達(dá)IL-8。成纖維細(xì)胞對LPS或其他炎性介質(zhì)的不同反應(yīng),可能構(gòu)成了不同組織在炎癥反應(yīng)中的不同特征。細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞信號系統(tǒng),被認(rèn)為在很多結(jié)締組織和上皮組織構(gòu)成器官的發(fā)展、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和創(chuàng)傷愈合中,在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)揮最重要的作用。角膜因為沒有像皮膚等器官那樣的血管、皮脂腺、毛囊或混雜其他組織,在研究信號系統(tǒng)時成為特殊的模型[7]。

本研究結(jié)果提示TPCA-1通過抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)可能會抑制炎性細(xì)胞的趨化,對免疫細(xì)胞和組織固有細(xì)胞各自發(fā)揮多種作用。IKK-2的小分子抑制物TPCA-1最近被發(fā)現(xiàn)有希望用于治療炎癥性疾病如哮喘[8]、關(guān)節(jié)炎[9]以及眼部堿燒傷等情況的動物模型[10,11],并且安全有效。最近有人證實中性粒細(xì)胞刺激角膜基質(zhì)膠原降解[12],炎性細(xì)胞和角膜固有的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的相互作用在角膜炎癥中發(fā)揮重要的作用。TPCA-1可以對IL-6,IL-8及細(xì)胞表面ICAM-1有顯著的抑制作用提示TPCA-1在抑制感染性角膜炎癥中可能發(fā)揮更重要的作用。它是否有副作用尚需進(jìn)一步探討。

在原始上皮和內(nèi)皮細(xì)胞,地塞米松抑制了NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄活性,但不改變IB水平或NF-κB的核轉(zhuǎn)位。我們證實了相似的機(jī)理出現(xiàn)在角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞。IKK-2阻滯劑在抑制脂多糖誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞炎性因子表達(dá)和膠原降解方面與地塞米松有相似作用,但是兩種藥物會發(fā)揮不同的作用機(jī)理[12,13]。IKK-2對NF-κB的激活發(fā)揮中心作用[14]。我們從實驗中證實,選擇性IKK-2受體抑制劑TPCA-1對抑制脂多糖誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-6、IL-8以及細(xì)胞表面ICAM-1。

我們證實了IKK-2受體阻滯劑(TPCA-1)能在炎癥反應(yīng)中抑制IL-6、IL-8、ICAM-1等表達(dá),是由于它阻斷了IB磷酸化和降解以及繼發(fā)的NF-κB核轉(zhuǎn)位。提示IKK-2受體阻滯劑(TPCA-1)可能成為治療角膜潰瘍除地塞米松外的另一種選擇或補(bǔ)充?？赡艹蔀橹委熃悄兯幬锇l(fā)展方面新的選擇。

以文章中的實驗結(jié)果作為前期工作和基礎(chǔ),我們可以進(jìn)一步深入探討角膜炎癥和角膜基質(zhì)膠原降解的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。并利用LPS建立角膜潰瘍動物模型,進(jìn)而進(jìn)行體內(nèi)試驗,探討TPCA-1抑制角膜基質(zhì)膠原降解及角膜潰瘍的機(jī)制,從而為臨床上治療角膜潰瘍這一嚴(yán)重致盲眼病提供重要的參考依據(jù)。

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